内容提要
本文设计了一种基于二氢吲哚骨架的近红外二区（NIR-II）聚集诱导发光（AIE）诊疗探针，具有双活性氧（ROS）和近红外光级联激活特性。当肿瘤微环境中ROS被激活时，TT-DHIn会转化为TT-In，表现出NIR-II荧光发射和光动力/光热治疗(PDT/PTT)能力，从而成为具有特殊信号背景比的光激活“引导雷达”。在预激活后，TT-In在660 nm激光照射下有效地产生ROS，使肿瘤ROS实现自我补充。此外，肿瘤内的TT-DHIn经历了循环转化为TT-In，显著提高光疗效果，并显示强大体外细胞毒性和体内肿瘤杀灭能力。这种双激活级联策略将肿瘤生物标记物的响应与光激活协同结合，为NIR-II成像引导的精密光疗和临床应用提供广阔前景。
TT-DHIn的制备和光物理性质研究
5-(4-(二苯氨基)苯基)噻吩-2-甲醛与1-乙基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚碘化物反应生成了化合物TT-In，产率为88 %。用硼氢化钠还原得TT-DHIn。在DMSO/水(fw=99 %)共溶剂中，TT-DHIn和TT-In分别在383 nm和554 nm处有明显的主吸收峰。与TT-DHIn相比，TT-In的最大吸收波长红移了171 nm，这对于监测TT-DHIn通过氧化脱氢转化为TT-In非常有利。在DMSO溶液中，TT-In显示了NIR-II窗口发射尾部荧光，归因于高电子给体-受体(D-A)强度。TT-In的NIR-II荧光信号穿透深度约为10 mm，比商用吲哚青绿(ICG)的NIR-II信号穿透深度深两倍。与ICG相比，TT-In在相同的渗透深度下总是表现出更高的SBR比率。随着甲苯百分数(FT)从0增加到90 %，TT-In的发射强度逐渐增加，在二甲基亚砜/甲苯混合物(FT=90 %)中，聚集状态的TT-In发射强度约为二甲基亚砜溶液中的3.9倍，符合典型AIE行为。为了研究TT-In在660 nm激光照射下的光动力学活性，使用2,7-二氯二氢荧光素(DCFH)来评价其产生ROS的能力。经50 S、660 nm激光照射后，存在TT-In的DCFH在525 nm处的荧光强度增加143倍，表现出比Ce6(33倍)和DCFH(2倍)更高的ROS产生效率。因此，AIE光敏剂TT-In的光催化效率远远优于常规光敏剂Ce6。TT-In的高光动力效率可能由于较小的单重态-三重态能隙(ΔEst)。此外，TT-In在660 nm激光照射下能有效地产生O2·−和·OH，表明其主要的I型ROS活性。与9,10-二苯二基双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)相比，在TT-In存在下，ABDA在378 nm处的吸收强度逐渐减弱，表明辐照时产生了II型ROS。进一步研究了TT-In在660 nm激光照射下的光热转化行为。TT-In显示对激光强度和浓度、温度的依赖性，且高达67.39 %的光热转换效率。此外，Tt-In(200 μm)在DMSO溶液中经660 nm激光(0.5 W cm−2)照射300 s时温度达到95.5 ℃，显示出良好的光热行为。与商业ICG相比，TT-In具有良好的光热稳定性。经过10个周期的激光照射/冷却，TT-In的最高温度基本保持不变。
TT-DHIn的可激活性能
为了验证TT-DHIn到TT-In的ROS可激活转换，使用亚甲蓝(MB)作为外源ROS诱导剂来产生I型和II型ROS。在660 nm激光照射(0.2 W cm−2)10 min后，TT-DHIn+MB组的吸光度增加了9.4倍，在554 nm处的荧光强度和在1000 nm处的荧光强度增加了14.5倍。这是因为TT-DHIn的ROS通过氧化脱氢激活转化为相应的TT-In。相比之下，TT-DHIn单独显示的吸收和荧光强度没有明显变化，而对MB的吸收和荧光强度逐渐降低，这主要是因为其光稳定性较差。同时，NIR-II荧光图像进一步验证了TT-DHIn的ROS激活能力。随后，我们在TT-DHIn系统中加入不同比例的TT-In来模拟TT-DHIn在体内的部分激活，然后系统地研究了TT-DHIn的光活性。当TT-In组分的添加量从0到40 %时，TT-In在660 nm激光(0.5 W cm−2)照射下的荧光强度，比554 nm和1000 nm处的荧光强度放大了157倍和87.5倍，这归因于TT-In在光照射下产生了ROS。NIR-II荧光图像、核磁共振氢谱和高效液相色谱进一步证实了TT-DHIN光活化转化为TT-In。这些结果表明，TT-DHIn在660 nm激光照射下的光活化效率与TT-In的浓度呈正相关。通过延长照射时间，TT-DHIn吸收和荧光强度的逐渐增加，这可能是因为TT-DHIn通过光氧化脱氢反应转化为TT-In所致。以MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231肿瘤球体为模型，系统研究了TT-DHIn的ROS激活和光级联激活性能。与TT-DHIn和MB共同孵育后，照射后MDA-MB-231细胞内荧光信号逐渐增强，而TT-DHIn或MB单独孵育后细胞内荧光信号无明显变化。这种现象可能是由于MB光照射下产生的ROS导致TT-DHIn氧化脱氢转化为TT-In所致。为了进一步研究TT-DHIn在部分激活条件下的光活化性能，构建了3D MDA-MB-231肿瘤球体模型。TT-DHIn处理的三维肿瘤球体被点亮，这可以归因于在多细胞肿瘤球体微环境中ROS的激活下TT-DHIn有效地转化为TT-In。光照5 min后，其荧光强度明显增强，这是由于TT-In在光激活状态下产生的ROS能够自我补充肿瘤细胞，从而使TT-DHIn能够被循环激活。
系统研究了TT-DHIn的ROS活化和光活化机理。首先，为了验证TT-DHIn是被I型ROS激活还是被II型ROS激活，在含有20 %TT-In的TT-DHIn体系中加入不同的ROS猝灭剂。在TT-DHIn/TT-In混合物中加入自由基猝灭剂(Trolox)后，TT-DHIn在554 nm处的吸收强度在660 nm激光(0.5 W cm−2)照射下变化很小。相比之下，TT-DHIn的吸收强度在554 nm处，无论单线态氧猝灭剂(NaN3)是否存在，其荧光强度也有相似的增强作用。这些结果表明，TT-DHIn主要经历氧化脱氢反应，通过自由基激活转化为TT-In。随后，用不同类型的ROS和活性氮物种(RNS)对TT-DHIn进行处理，以验证其特定的活化性能。与其他类型的ROS和RNS相比，TT-DHIn在554 nm处的吸收强度，1000 nm处的荧光强度，以及NIR-II荧光信号在·OH处理后显著增强，表明·OH具有特定的激活能力。同时，TT-DHIn的吸收和荧光强度也表现出·OH浓度依赖性。因此，提出了一种潜在的激活机制：TT-DHIn可以通过·OH介导的氧化脱氢反应转化为TT-In，在近红外光照射下，TT-In从基态转变为激发三重态。在从激发单重态到激发三重态的转变过程中，通过电子转移生成·OH，进一步激活TT-DHIn转变为TT-In，实现了ROS和NIR光级联激活特性。此外，在37 °C黑暗条件下用HPF(50 μm)处理3 h后，检测到MDA-MB-231球形肿瘤有强烈的绿色荧光信号，表明TME中丰富的·OH可以有效地激活TT-DHIn转化为TT-In。
体外细胞内分布和光动力学活性
通过共定位实验进一步研究TT-In在MDA-MB-231细胞内的分布。TT-In/MitoTracker的皮尔逊相关系数(0.93)高于TT-In/LysoTracker的皮尔森相关系数(0.61)，表明其具有良好的线粒体靶向能力。以DCFH-DA为指示剂，评估TT-DHIn和TT-In在660 nm激光照射下细胞内ROS生成情况。在MDA-MB-231细胞中显示出强烈的绿色荧光。通过流式细胞仪对ROS阳性细胞的定量检测，也验证了相应的性质，表明其具有良好ROS生成能力。另外，TT-In和TT-DHIn可有效降低照射后MDA-MB-231细胞线粒体膜电位。活/死细胞检测实验表明，与对照组相比，TT-DHIn联合激光照射可以有效地杀灭体外癌细胞。TT-DHIn在DMEM系统中表现出极好的稳定性。用MDA-MB-231细胞和正常MCF-10A细胞评价TT-DHIN和TT-In的体外细胞毒作用。在660 nm激光照射下，TT-DHIn(10 μm)处理的细胞存活率降至26 %，而黑暗条件下的细胞存活率则高得多，接近100 %。虽然TT-In对MDA-MB-231细胞显示出显著的细胞毒性，但在5 μm的浓度下，正常的MCF-10A细胞的细胞存活率极低(0.8 %)。TT-DHIn在正常乳腺癌细胞中具有良好的生物安全性，在100 μm浓度下也被证实。这些结果表明，TT-DHIn不仅对肿瘤细胞具有良好的光治疗效果，而且显著降低了非靶向的药物毒性。最后，用Annexin V-FITC/DAPI法检测了光疗条件下MDA-MB-231细胞的死亡机制。TT-DHIn和激光照射处理的MDA-MB-231细胞的凋亡率为32.12 %，而对照组、激光和TT-DHIn在黑暗条件下的凋亡率较低。同时，TT-In + L组的细胞凋亡率也较高。这些结果提示TT-DHIn和TT-In通过细胞凋亡机制具有良好的光疗效果。
体内光疗
为了进一步研究TT-DHIn在体内的ROS和光级联激活特性，建立了携带MDA-MB231肿瘤的裸鼠模型。注射TT-DHIn后，在肿瘤部位观察到NIR-II荧光信号，SBR高达11.5。这可能是因为在肿瘤微环境中ROS激活下，TT-DHIn通过氧化脱氢迅速转化为TT-In。相比之下，ICG仅显示肿瘤部位的SBR较低，为1.8。这些结果表明，ROS和光级联可激活的TT-DHIn适合于高SBR的肿瘤成像。随后，肿瘤部位的NIR-II荧光信号可以作为光激活“引导雷达”，利用光的高时空可控性，用660 nm激光选择性照射肿瘤5 min。在660 nm激光照射下，由于瘤内ROS的自我补充，肿瘤部位的NIR-II荧光强度显著增强。此外，肿瘤部位残留的TT-DHIn也可以周期性地转化为TT-In，增强光疗活性。TT-DHIn治疗的小鼠在660 nm激光照射10 min后，肿瘤温度达到了53.1 °C，证明了热疗的有效性。相比之下，生理盐水组的体温波动很小。进一步研究TT-DHIn的体内抗肿瘤作用。与其他治疗条件相比，TT-DHIn和TT-In在660 nm激光照射下能有效地清除荷MDA-MB-231裸鼠的肿瘤。同时，治疗21天后，对不同治疗组的肿瘤组织进行解剖，通过肿瘤组织照片、重量、苏木精-伊红染色和TUNEL染色，验证TT-DHIN+L组和TT-In+L组的肿瘤光疗作用。还基于组织切片的TUNEL染色对凋亡阳性信号区域的面积进行了定量分析。在条件ROS和660 nm激光照射下TT-DHIn的光疗活性被有效激活，TT-DHIn+L组和TT-In+L组的隧道阳性信号较其他组显著增加。
结论
本文开发了一种多功能的ROS-和NIR光级联可激活的NIR-II AIE热敏剂TT-DHIn，它具有特异·OH响应性、高光活化效率和良好生物安全性。活化后的TT-DHIn表现出NIR-II发光、具有强·OH生成能力，实现高效光热转化。利用ROS激活进行NIR-II荧光成像，实现体外多细胞肿瘤球体和体内皮下肿瘤的清晰可视化，并具有显著信噪比。这种成像能力使精确光激活指导成为可能，通过TT-DHIn循环激活显著提高了肿瘤PDT/PTT疗效。双激活级联放大策略创新性地将肿瘤生物标记物(ROS)的响应性与光激活机制相结合，为影像引导精确肿瘤治疗提供了巨大希望。
参考文献
From Spark to Flame: ROS- and Light-Cascade Activatable NIR-II AIE Probe for Precise Tumor Imaging and Self-Amplifying Phototherapy, Xiaohui Chen,* Yuanyuan You, Songling Lin, Chengwei Tang, Jun Zhu, Qiongwen Liang, Dan Rao, Jiali Deng, Yuxun Ding, Dingyuan Yan, Wenman Li, Dong Wang,* and Ben Zhong Tang*, Adv. Sci. 2025, e14789，https://doi.org/10.1002/advs.202514789
