内容提要
光动力疗法(PDT)是一种非常有效的肿瘤消融策略,依靠光敏剂(PSs)在光照射下产生活性氧(ROS),诱导癌细胞死亡｡然而,PS亚细胞靶向对肿瘤消融效率的影响尚不清楚｡为了解决这个问题,设计并系统研究了三种具有不同细胞器靶向能力的聚集诱导发射发光原(AIEgens)｡在这些PSs中,线粒体靶向的MeOTFPy和溶酶体靶向的TPE-TFPy在溶液和体外比细胞膜靶向的MeOTFVP产生更高水平的ROS｡此外,线粒体靶向的MeOTFPy显示出优越的口腔癌消融能力,主要是由于其诱导线粒体功能障碍和随后的焦亡激活的能力｡这种增强的治疗效果突出了线粒体在ros介导的细胞死亡途径中的关键作用｡这项研究强调了亚细胞靶向在PSs设计中的重要性,并为通过焦亡改善癌症治疗策略提供了一条有希望的途径｡
结果和讨论
分子设计和光物理性质
三种AIEgens (MeOTFVP､MeOTFPy和TPE-TFPy)的分子设计｡这些PSs是由具有供体-受体(D-A)结构的共同分子核开发而成的｡这种D-A结构促进了长波长发射的分子内电荷转移(ICT),增强了系统间交叉(ISC),从而有效地产生ROS。AIEgens的紫外-可见吸收光谱｡MeOTFVP､MeOTFPy和TPE-TFPy的吸收峰分别位于506､508和491 nm处,具有相似的光吸收特性｡为了评价这些分子的AIE性质,在含有不同比例的二甲亚砜(DMSO)和甲苯的溶剂混合物中记录了光致发光(PL)发射光谱｡这三种分子在600-750 nm范围内具有较强的AIE特性｡值得注意的是,当溶解在95%甲苯/DMSO混合物中时,AIEgens的PL强度比它们在纯DMSO中的行为显著增加｡具体来说,MeOTFVP､MeOTFPy和TPE-TFPy分别表现出约8倍､20倍和25倍的PL强度增强｡采用DCFH-DA(2 ',7 ' -双乙酸二氯荧光素)作为荧光探针,对AIEgens的ROS生成能力进行了评估｡在白光照射(7 mW cm−2)下,AIEgens存在时,DCFH-DA的荧光强度显著增加,证实了它们产生ROS的能力｡在三种AIEgens中,MeOTFPy和TPE-TFPy表现出相当的ROS生成效率,照射180 s后荧光强度分别增加147倍和130倍｡相比之下,MeOTFVP的ROS生成效率明显较低,在相同条件下DCFH-DA荧光仅增加30倍｡这些发现共同证实了这三种AIEgens能够吸收可见光产生ROS,强调了它们作为癌症PDT的ps的潜力｡
亚细胞定位
先前的研究表明,具有相似结构框架的分子可以选择性地靶向特定的亚细胞细胞器,如细胞膜､线粒体､和溶酶体｡为了确认合成的AIEgens的亚细胞定位,使用CAL27细胞系进行体外细胞成像｡将AIEgens与已建立的细胞器特异性荧光跟踪器､用于细胞膜的CellMask､用于线粒体的MitoTracker和用于溶酶体的LysoTracker共孵育｡共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)的结果,证实了AIEgens的细胞器靶向能力｡MeOTFVP展出利用CelMask实现出色的共定位,共定位系数≈0.88｡这一结果表明,MeOTFVP在靶向细胞膜上是非常有效的｡MeOTFVP的靶向能力可归因于将季铵尾部与吡啶部分连接起来的烷基链,这降低了其渗透细胞膜的能力,从而促进了其在膜表面的积累｡MeOTFPy含有一个吡啶片段,对线粒体具有很强的靶向性｡它与MitoTracker进行了很好的共定位,共定位系数为0.90｡吡啶部分可能在使MeOTFPy优先积聚在线粒体中起关键作用｡另一方面,TPE-TFPy具有疏水片段,这增强了其在溶酶体内的定位能力｡与LysoTracker共染色实验证实了这种溶酶体的靶向性,共定位系数为0.81｡这些相对较高的共定位系数证明了分子设计在特定细胞器上实现靶向积累的成功｡这种细胞器特异性靶向对于提高PDT的准确性和有效性至关重要,因为它允许在预定的亚细胞位点产生局部ROS和损伤｡
细胞内ROS检测与体外PDT
为了进一步研究诱导细胞内ROS生成的能力,将CAL27细胞与三种AIEgens一起孵育,然后在培养基中加入DCFH-DA｡在白光照射下,TPE-TFPy处理的细胞显示出明亮的绿色荧光,表明ROS产生强劲｡在相同条件下,MeOTFPy处理的细胞荧光强度相似,而meotfvp处理组的荧光强度明显较弱｡ROS水平的定量分析,证实了荧光成像结果｡TPETFPy和MeOTFPy均产生相当水平的细胞内ROS,显著高于MeOTFVP｡重要的是,这些实验是在一致的条件下进行的,即相同的光强､AIEgen浓度和孵育参数,确保了比较的可靠性｡这些发现表明,三种AIEgens细胞ROS生成的差异可能归因于它们在溶液中的ROS生成｡为了评估PDT的细胞毒性作用,在黑暗和白光照射条件下进行了细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)试验｡MeOTFPy在光激活后表现出最高的细胞毒性,在低浓度(1 μm)下有效抑制CAL27细胞生长,在高浓度(5和10 μm)下完全消除癌细胞｡相比之下,TPE-TFPy和MeOTFVP仅在最高测试浓度(10 μm)下表现出显著的细胞毒性｡有趣的是,尽管TPE-TFPy靶向溶酶体和MeOTFPy之间的细胞内ROS生成水平相当针对线粒体,TPE-TFPy在相同条件下显示可忽略不计的细胞毒性作用｡ROS产生和细胞毒性之间的差异强调了亚细胞定位在确定PDT疗效中的关键作用｡ROS的短寿命和有限的扩散范围意味着它们的治疗效果高度依赖于产生部位｡重要细胞器附近的局部ROS生成对于诱导有效的细胞死亡至关重要｡在这些细胞器中,线粒体在调节细胞死亡途径(包括焦亡和凋亡)中起着核心作用｡靶向线粒体的PSs,如MeOTFPy,可以通过局部ROS产生有效地破坏线粒体功能,与靶向不太关键细胞器的PSs相比,可以更有效地诱导细胞死亡｡为了进一步验证三种AIEgens的PDT作用,我们用Calcein-AM/PI染色来区分处理后的活细胞和死细胞｡该方法为每种PS在不同条件下的细胞杀伤效率提供了额外的证据,强化了亚细胞靶向和局部ROS产生对提高PDT疗效的重要性｡MeOTFPy加光处理组(MeOTFPy + L)仅在红色通道(PI染色)上观察到荧光信号,绿色通道(Calcein染色)未检测到荧光｡这些结果与CCK-8实验一致,证实了MeOTFPy在白光照射下的最强PDT效应｡总之,体外实验表明,MeOTFPy通过在线粒体中产生ROS有效地消融CAL27细胞｡进一步的研究使用膜联蛋白V染色来阐明meotfpy诱导细胞死亡的确切机制｡MeOTFPy + L组在红色和绿色通道均显示出明亮的荧光,而其他组无明显信号｡膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸结合,在细胞凋亡过程中磷脂酰丝氨酸从细胞膜内转运到细胞膜外,表明MeOTFPy诱导细胞凋亡介导的细胞死亡｡然而,处理后的CAL27细胞表现出明显的形态学变化,包括明显的肿胀和大量气泡的形成,这些变化通常与经典的细胞凋亡无关｡另一种类型的细胞死亡,焦亡,以细胞膜肿胀为特征,可能与meotfpy诱导的细胞死亡相匹配。
CAL27荷瘤小鼠体内PDT
上述结果证明了所提出的三种AIEgens在体外PDT中的有效性,其中MeOTFPy表现出优于MeOTFVP和TPE-TFPy的性能｡然而,它们在体内的治疗潜力尚不清楚｡为了解决这个问题,我们设计了一项体内研究,使用肿瘤模型来评估MeOTFPy的PDT效果,并进行了全面的生物安全性评估｡为了构建肿瘤模型,将CAL27细胞皮下注射到BALB/c裸鼠体内三种AIEgens的给药方案遵循先前研究中建立的程序｡随后,每组中一半的小鼠,包括注射PBS的小鼠(对照组),接受白光照射20分钟,从治疗后第0天到第14天记录肿瘤体积,以监测治疗结果｡仅MeOTFPy + L组肿瘤体积明显减小,表明其在体内具有较强的PDT疗效｡相比之下,所有其他组显示出类似的肿瘤生长模式,表明肿瘤进展迅速,PDT有效性较低｡值得注意的是,TPE-TFPy + L组和MeOTFVP + L组的肿瘤生长趋势与对照组相似,进一步强调了它们的治疗效果有限｡体重监测结果,各组均无显著变化,表明MeOTFPy､MeOTFVP和TPE-TFPy在治疗期间表现出良好的生物安全性｡这些发现证实,MeOTFPy不仅在体外表现优于其他AIEgens,而且在体内也表现出强大的PDT效应,副作用最小,使其成为进一步治疗应用的有希望的候选药物｡用荧光成像方法观察每一种AIEgen对小鼠注射后的生物分布｡在注射和光照的第1天,小鼠肿瘤显示出清晰的荧光信号｡到第14天,注射MeOT-FVP的小鼠荧光信号明显减弱,表明该化合物很可能被代谢并排出体外｡相比之下,注射MeOTFPy和TPE-TFPy的小鼠肿瘤在第14天继续发出强烈的荧光,表明这些AIEgens的代谢速率较慢｡尽管代谢率存在差异,但血液学和生化分析表明,三种AIEgens均保持了优异的生物安全性｡关键参数如红细胞(RBC)计数､血红蛋白(HGB)､平均红细胞血红蛋白浓度(MCH)､平均红细胞体积(MCV)､血小板计数(PLT)､丙氨酸转氨酶(ALT)､天冬氨酸转氨酶(AST)､γ-glutamyl转肽酶(GGT)､血尿素氮(BUN)和肌酐(CREA),与PBS对照组相比,所有组的肝脏和肾脏功能指标均保持在正常范围内｡此外,主要器官的H&E染色未见异常,器官组织学表现正常,与PBS组相当｡
结论
在这项研究中,我们提出了一类具有出色的亚细胞细胞器靶向能力和强大的ROS生成能力的AIE PSs｡其中,线粒体靶向PS MeOTFPy显示出诱导肿瘤细胞焦亡的能力,这是有效消除肿瘤细胞的关键机制｡相比之下,靶向细胞膜的PSs表现出最低的ROS生成能力,并且在通过PDT杀死肿瘤细胞方面基本无效｡有趣的是,两种具有相当ROS生成能力的PSs产生了截然不同的治疗结果｡
参考文献
Subcellular Targeting and Pyroptosis Activation ofAggregation-Induced Emission Photosensitizers for Enhancing Photodynamic Therapy of Oral Cancers，Ying Peng, Zeyang Ding, Rufan Mo, Huilin Xie, Song Wu, Yuqing Li, Juan Du, Zijie Qiu, Ryan T. K. Kwok, Zheng Zhao,* Jianquan Zhang,* and Ben Zhong Tang*，Adv. Funct. Mater. 2025, e24915，https://doi.org/10.1002/adfm.202524915
