内容提要
为了提高光疗性能，迫切需要具有高活性氧(ROS)生成，良好的肿瘤靶向能力和持久的保留能力的药物。然而，对称供体-受体(D-A)型药物通常产生球形纳米聚集体，导致良好的肿瘤靶向性，但保留率较低。杆状纳米聚集体可以延长其在肿瘤中的保留时间;然而，这仍然是一个挑战。结合不同形态优点的动态变化形状的智能体很少被报道。因此，本文采用不对称D-A型TIBT设计了具有智能形状可调性的自组装有机纳米聚集体。TIBT在固体中的光致发光量子产率高达52.24%。TIBT在相应的纳米聚集体(TIBT-NCs)中也显示出高ROS生成。TIBT-NCs中发生了从纳米球到纳米棒形状变化的动态自组装，有助于将ROS量子产率从0.55提高到0.72。此外，在体外和体内都可以观察到动态自组装，赋予TIBT-NCs强大的肿瘤靶向性和长时间的保留。最后，在TIBT-NCs中实现了有效的光动力治疗来抑制肿瘤生长，抑制率为90%。不对称D-A型药物可以在形成自组装有机纳米聚集体中发挥重要作用，从而在长效癌症治疗中显示出巨大的潜力。
TIBT的合成和光物理性质研究
采用三苯胺单元(TPA, D)和咪唑[4,5-f]−2,1,3苯并噻唑单元(IBT, A)，可以通过Suzuki交叉偶联反应得到D - A - D结构的对称DTIBT)。这与光疗中大多数D-A型有机制剂的情况相似。值得注意的是，通过使用几乎相同的前体和方法，还制备了不对称D-A型TIBT有机染料。DTIBT和TIBT的产率差异较大，分别为6.4%和59.1%。说明在这里的反应条件下，具有较大位阻的IBT单元中的溴很容易丢失。这也说明了引入单侧位阻合成不对称化合物的可行性。然后研究了DTIBT和TIBT在四氢呋喃(THF)中的光学性质。DTIBT和TIBT的吸收光谱相似，最大吸收波长为≈505 nm。同时，TIBT的摩尔消光系数较高，为7.66 × 104 m−1 cm−1。DTIBT和TIBT都在600-850 nm的深红色区域表现出有效的发射，产生≈200 nm的大Stokes位移。在不同溶剂中，它们的辐射随着极性的增加而显著红移，表明极性介质中存在很强的分子内电荷转移(ICT)效应。然后对DTIBT和TIBT的不同水馏分(fw)的THF/水混合物的PL光谱进行了研究。当fw增加到90%时，TIBT的荧光强度比在THF溶液中提高了7.3倍，表现出令人印象深刻的聚集诱导发射(AIE)。随后，评估了它们在固体中的排放量。DTIBT在溶液和固体中均获得了相似的PL光谱;然而，TIBT的固体中出现了明显的≈100 nm的蓝移，与溶液中淬灭的发光相比，其光致发光量子产率(PLQY = 0.02%)显著提高了52.24%。为了进一步了解DTIBT和TIBT的光学性能，进行了理论计算。利用密度泛函理论(DFT)在B3LYP/6-31g(d,p)水平上对它们的分子几何形状进行了优化。两种分子均出现扭曲构象，特别是DTIBT，这是由其大的位阻引起的。这导致DTIBT和TIBT的最高占据分子轨道(HOMO)相似。相反，DTIBT和TIBT的最低未占据分子轨道(LUMO)主要位于吸电子单元上。相似的前沿分子轨道和能级进一步证明了它们相似的吸收和发射光谱。为了揭示光激发下的几何变化，我们计算了DTIBT和TIBT的重组能(和光激发下)。在气相中，DTIBT和TIBT分别得到4345和5863 cm−1的值。可以观察到，TIBT的大部分值都位于低频区域，对应于剧烈的扭转运动。同时，77.42%的变化是由二面角的变化引起的。这些因素导致TIBT在激发时的非辐射衰变占主导地位，这与溶液中的淬火发射一致。为了研究它们在聚集态下的重组能，我们分别培养了DTIBT和TIBT晶体;然而，我们只得到结晶TIBT。与溶液相比，TIBT晶体中的λ值降至1514 cm−1，二面角的比例显著降低(31.70%)。显然，TIBT的分子内运动在聚集状态下被抑制，导致固体中令人印象深刻的PLQY。同时，还预测了单重态和三重态之间的能隙(∆ES1-T1)和自旋轨道耦合，以评估系统间的交叉和ROS的产生。在气相中，DTIBT和TIBT的∆ES1-T1值比较接近。而对于结晶TIBT，对应的∆ES1-T1值略有下降，大幅提高至0.398 cm−1，表明在聚集态下，系统间杂交速率更快，ROS生成效率更高。这些数据表明TIBT作为一种具有高亮度和高效ROS生成的高效光敏剂(PS)的潜力。
TIBT纳米粒子的制备和自组装研究
为了提高DTIBT和TIBT在生物应用中的生物相容性和稳定性，采用一步纳米沉淀法，利用两亲性聚合物DSPE-PEG2k制备相应的纳米聚集体。将DTIBT/TIBT和DSPE-PEG2k的THF混合溶液快速滴入水中，剧烈搅拌30 s，然后在通风橱中静置2 h。利用透射电子显微镜(TEM)和选择区域电子衍射(SAED)对纳米聚集体的尺寸分布和形貌进行了表征。与我们之前的工作类似，分子间力的增强促进了DTIBT和TIBT分子的有序排列和自组装，从而成功制备了单分散纳米晶体(nc)。得到的DTIBT-NCs和TIBT-NCs均为球形，平均尺寸分别为≈70 nm和≈50 nm。有趣的是，随着时效时间的增加，观察到完全不同的装配行为。对于dtibt - nc，没有发生逐步的自组装，并且形态保持稳定为球形颗粒超过5天，没有明显的尺寸变化。未经任何处理的TIBT-NCs可以观察到连续和动态的自组装。最终，纳米聚集体从最初的小球形材料(≈50 nm)转变为长径比大的棒状材料(≈700 nm)。详细的尺寸分布如图所示。此外，根据相应的SAED模式，在TIBT的所有纳米聚集体中都观察到结晶性质。为了深入研究基于tibt的纳米聚集体的自组装过程，使用冷冻透射电镜(cro - tem)捕捉了它们在第一天和第五天的。观察到，TIBT-NCs在5天内由球形变为长棒状，尺寸从≈100 μm增加到≈1 μm。此外，基于tibt的纳米聚集体也可以记录SAED模式的衍射信号。这些发现与透射电镜的结果高度一致，支持tibt基纳米聚集体的动态自组装。此外，通过动态光散射监测自组装过程中的水动力尺寸。最初，尺寸小于90纳米的小颗粒占主导地位。随着时间的推移，tibt基纳米聚集体中出现了更多的大尺寸结构，甚至达到了微米级。最后，大部分骨料成为大型结构。众所周知，纳米聚集体的形状和大小会受到其制备条件的显著影响。因此，本文研究了不同条件下制备的TIBT- nc，包括调节TIBT的浓度及其与DSPE-PEG2k的比例。首先，确定TIBT与DSPE-PEG2k的比例为1:2，分别制备浓度为20、40和100 μg mL−1的TIBT- nc。结果表明，在浓度为20、40和100 μg mL−1时，这些TIBT- nc的粒径分别达到50、150和200 nm。随后，杆状结构逐渐出现在这些纳米系统中。第5天，大多数纳米球转化为大尺寸棒，尺寸分别为700、1200和2200 nm。此外，为了进一步研究TIBT- ncs的组装，这里还加入了TIBT与DSPE-PEG2k的1:4和1:10的比例。测定TIBT-NCs浓度为20 μg mL−1。与1:2比例制备的tibt - nc类似，这两种情况也表现出“球到棒”的过程。因此，得益于TIBT-NCs中有效的分子间相互作用，在所有这些情况下都可以很好地获得动态形状可转性。另一方面，我们通过XRD分析深入研究了TIBT-NCs的组装过程。第1天，TIBT-NCs分别在12.45°、19.03°和23.33°处出现弱衍射峰。随后，随着TIBT纳米聚集体中棒状结构的形成，这些衍射峰的信号逐渐增强。同时，在8.17°、10.82°、14.48°、21.33°和26.00°处出现了可见的衍射峰，表明棒状TIBT-NRs可能具有更多的分子间相互作用和更强的晶体堆积。制备的tibt - nmr与单晶的XRD谱线进行了比较。尽管有部分重叠的衍射峰，但TIBT的这两条曲线并不完全相同，这表明它们的晶体包装不同。这些发现再次证实了TIBT分子间强烈的相互作用和良好的结晶度诱导了一种独特的动态和可控的自组装。
TIBT自组装体的体外性质研究
随后，我们研究了自组装过程中形状对荧光性能的影响。除了新鲜制备的球形DTIBT- ncs和TIBT- ncs外，还研究了老化的纳米聚集体(5天)，包括几乎不变的球形DTIBT纳米聚集体(dtibtns)和自组装的TIBT纳米棒(TIBT- nrs)。首先，测试了吸收/发射特性。尽管其自组装能力不同，但DTIBT和TIBT纳米聚集体的吸收光谱和PL光谱相似。然而，与基于dtibt的球形纳米管相比，TIBT-NCs和TIBT-NRs都获得了优越的近红外发射性能，PLQY值高达27%，且稳定。然后记录了tibt基纳米聚集体的瞬态荧光光谱。总结了它们对应的寿命()和其他光物理性质，包括辐射衰减率(kr)和非辐射衰减率(knr)。TIBT-NCs和TIBT-NRs的数据值相近，分别为4.42和5.30 ns。这导致了相似的kr (6.11 × 107和5.11 × 107 s−1)和knr (16.51 × 107和13.76 × 107 s−1)值。此外，这些纳米聚集体在暴露于恒定光照射时也表现出良好的光稳定性。此外，DTIBT和TIBT在THF溶液和自组装纳米聚集体中的ROS生成能力以2 '，7 ' -双乙酸二氯荧光素(DCFH-DA)为指标进行评估。我们将DCFH-DA活化溶液加入到上述体系中，并在525 nm白光照射(400-800 nm, 25 mW cm−2)下监测其荧光强度的变化。ROS生成速率定义为ln (Em/Em0)与时间的比值，其中Em为光照射下DCFHDA的最大PL强度，Em0为未照射时的初始强度。可以看到，在所有这些情况下，DTIBT和TIBT在纳米聚集体中都实现了高效的ROS生成，这比在溶液中要好得多。其中，DTIBT溶液、DTIBT- ncs和DTIBT- nss的ROS生成率分别为0.12、0.44和0.39 min−1。还注意到，自组装TIBT纳米聚集体表现出更好的性能，其中ROS生成速率大大提高了约19倍(0.58 min−1);。对于杆状TIBT-NCs，该值进一步增强到0.69 min−1。然后，使用Rose Bengal (RB, 0.75)作为参考，进一步记录这些纳米聚集体的ROS量子产率。基于tibt的纳米聚集体比DTIBT表现出更高的ROS量子产率，球形和棒状纳米聚集体的ROS量子产率分别为0.55和0.72。TIBT纳米聚集体的高ROS生成效率主要源于其紧密的堆积模式，限制了分子内运动等非辐射过程，从而促进了PDT过程中ROS的生成。本研究结果还进一步表明，由于TIBT在近红外区域具有高亮度，并且在“球环”自组装过程中具有出色的ros生成能力，因此它是构建高性能光疗平台的有希望的候选者。
为了研究TIBT-NCs在生物学应用中的形状可调性，我们首先研究了TIBT-NCs在一些典型的生物培养基(包括PBS和细胞培养基(DMEM))中的自组装特性。将新制备的tibt - nc分散在PBS和DMEM中，用透射电镜观察其形态。TIBTNCs在两种介质中表现出相似的组装行为，首先存在平均尺寸为100 nm的单分散球体，然后出现更多的棒状结构。第五天，可以得到大量长度约为700 nm的均匀棒状纳米结构。这些结果充分证明了TIBT的分子间相互作用力足以在一些复杂的环境中辅助自组装，进一步暗示了其在固定细胞、活细胞甚至体内的潜在应用。之后，小尺寸球形的DTIBT-NCs和大尺寸棒状的TIBT-NRs，以及动态组装的TIBT-NCs经历了“球环”，与细胞共培养，并通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察。商业的4,6-二氨基苯基吲哚(DAPI)用于靶向细胞核。对于固定的HeLa细胞，在孵育10小时后，所有纳米聚集体的荧光信号在细胞质中出现，表明细胞摄取有效。此外，利用几种商业染料研究了它们在细胞内的分布，包括Hoechst 33 342(一种核靶向探针)、LysoTracker Green DND-26(一种溶酶体靶向探针)和MitoTracker Green(一种线粒体靶向探针)。分别用DTIBT-NCs、TIBT-NRs和TIBTNCs对细胞进行染色。在这些纳米聚集体中，dtibt - nc主要位于溶酶体中，与LysoTracker Green DND26的Pearson相关系数(PCC)高达0.8112。对于TIBT-NRs和TIBT-NCs，尽管它们在细胞质中富集，但LysoTracker Green DND-26和MitoTracker Green的PCC值均小于0.8。与MitoTracker Green相比，TIBT-NRs和TIBT-NCs荧光信号与LysoTracker Green DND-26有较高的重叠，对应的PCC值分别为0.6326和0.7270。值得注意的是，当细胞用球形TIBT- ncs染色5天后，CLSM还捕获了细胞内纳米聚集体的动态自组装，从最初的点转变为长棒，这表明即使在HeLa细胞中，TIBT也是有效的驱动力。这可以通过相应的放大视图很好地可视化。在活细胞中进一步检测了它们的自组装能力。对于DTIBT-NCs，在所有5天内都记录到类似的点状荧光信号，表明形态稳定。然而，在TIBT-NCs的情况下，最初出现带有明亮信号的微小颗粒，但随着孵育时间的增加，它们逐渐改变。最后，观察到明显的棒状结构，对应于上述TIBT-NCs中的动态自组装。这进一步证明了TIBT的纳米组装行为适用于生物环境。
之后，使用DCFH-DA评估这些纳米聚集体在HeLa细胞中的ROS生成能力。在任何情况下，在黑暗中都没有捕获到细胞中的荧光。相比之下，激光照射(400-800 nm, 10 mW cm−2,5 min)可明显观察到绿色荧光信号，表明细胞中有效产生ROS。随后使用4T1(小鼠乳腺肿瘤细胞)和L929(小鼠成纤维细胞)细胞检测基于DTIBT和TIBT获得的纳米聚集体的细胞消融效率。无论在肿瘤细胞还是正常细胞中，即使在75 μg mL−1的高浓度下，这些纳米聚集体在黑暗中也能获得≈80%的高细胞活力。特别是，TIBT-NCs的自组装行为对细胞的毒性可以忽略不计，这对活细胞的长期成像和跟踪非常有利。然而，制备的纳米聚集体在光照射(400-800 nm, 140 mW cm−2,5 min)下表现出剂量依赖性的细胞毒性。其中，球形和棒状TIBT纳米聚集体都具有令人印象深刻的细胞杀伤能力。这比dtibt - nc要高得多，导致细胞存活率分别只有13%和10%。鉴于其良好的成像性能、良好的生物相容性以及在细胞内高效的PDT效应，下文将进一步将TIBT-NCs用于体内生物医学研究。
TIBT自组装体的体内荧光成像和光动力学治疗研究
采用4T1乳腺荷瘤BALB/c小鼠，在体内研究其光效作用。首先，研究了制备的纳米聚集体(包括DTIBT-NCs、TIBT-NRs和TIBT-NCs)的肿瘤靶向能力。制备的纳米聚集体静脉注射(1 mg mL−1,100 μL)，不同时间记录生物分布成像。如图5A所示，由于增强的渗透性和滞留性(EPR)作用，6小时后小球形DTIBT-NCs在肿瘤部位迅速积聚。然后，肿瘤处相应的荧光信号随时间增加，注射后24 h达到平台期。而对于大棒状的TIBT-NRs，肿瘤靶向性较差，约12 h出现微弱荧光，随后荧光强度稳步增强。以TIBT-NCs为例，注射到小鼠体内后，其初始纳米球形形态在约6小时内首先实现了良好、快速的肿瘤靶向。此外，正如在活细胞中所证明的那样，TIBT-NCs在体内也可以进行动态的自组装“球到棒”，从而导致在肿瘤部位的长时间滞留。36 - 60h内肿瘤内荧光信号较强，充分证明在肿瘤区域有效富集积累。此外，对器官和肿瘤组织成像进行荧光强度分析。与先前报道的球形纳米药物一致，DTIBT-NCs在网状内皮系统(RES)的作用下被肝脏和脾脏高度吸收。对于tibt - nr，在心脏、肺、肾脏、脾脏和肿瘤部位检测到信号，表明非特异性分布。值得注意的是，在TIBT-NCs的情况下，肿瘤部位出现的荧光信号远高于肝脏和脾脏的代谢器官，表明其具有良好的靶向能力。利用ImageJ对代谢区(ROI1)和肿瘤区(ROI2)的三种纳米聚集体在各时间点的荧光强度进行量化，并计算相应的比值IROI2/I ROI1。对于所有这些纳米聚集体，IROI2/IROI1值首先升高，这与它们在肿瘤初始阶段的有效积累相对应。然后，DTIBT-NCs和TIBT-NRs的IROI2/I ROI1值逐渐降低，其解释如下:1)尽管DTIBT-NCs等小尺寸纳米球最初在肿瘤中大量富集，但往往会从肿瘤中渗出，重新进入血液循环，从而迅速被肝脏清除。2) TIBT-NRs在体内的肿瘤靶向性较差，循环时间延长。这可能导致游离TIBT-NRs在代谢区不断积累，提高IROI1的值，降低IROI2/ IROI1的比值。有趣的是，与DTIBT-NCs和TIBT-NRs形成鲜明对比的是，TIBT-NCs的IROI2/I ROI1值持续增加，最终导致3倍的增强。这可以解释为tibt - nc首先以纳米球(≈50 nm)的形式进入血液，由于EPR效应迅速靶向肿瘤部位。随后，球形纳米聚集体遵循其自组装特性，逐渐转变为大尺寸的纳米棒，从而避免其从肿瘤中泄漏，实现有效的保留和积累。综上所述，基于TIBT制备的动态自组装有机纳米聚集体在光照射下具有长期作用的PDT潜力。
在抗肿瘤试验之前，我们在健康裸鼠体内检测了TIBT-NCs的代谢和生物安全性。连续记录小鼠NCs的荧光成像14天(336 h)。TIBT-NCs通过血流迅速扩散到全身，主要通过肝脏和脾系统摄入。24小时在肝脏中达到最大积累，随后逐渐降解和清除。相对强度在14天后降至0.11，表明制备的纳米聚集体几乎完全被体外代谢。代谢区随时间的相对荧光强度进一步证实了这些发现。此外，实验小鼠存活31天，表明TIBT纳米聚集体具有优越的生理安全性。为了提高光疗性能，大多数报道的有机光敏剂在抗肿瘤治疗期间被多次注射。然而，在本研究中，仅注射一次具有良好肿瘤靶向性和延长肿瘤保留时间的TIBT-NCs进行光疗检测(TIBT-NCs+LI1)。为了进行比较，我们检测了PBS、PBS+L、tibt - nc，甚至是三次注射的TIBTNCs+L (tibt - nc +L- i3)。每2天监测肿瘤大小，连续观察20 d。观察发现，PBS、PBS+L和TIBT-NC组肿瘤体积增大，而TIBT-NC +L- i3组肿瘤生长受到极大阻碍。高剂量TIBT-NCs在光照下显著降低肿瘤体积。更重要的是，低剂量治疗获得了相似的光疗结果，平均抑制率超过90%。这些结果表明，增强tibt - nc中的肿瘤保留不仅提高了其PDT效率，而且大大简化了治疗方案，最终实现了长效抗癌治疗。此外，监测小鼠在治疗期间的存活情况，用TIBTNCs进行光疗的小鼠在25天内没有出现任何死亡。同时，各组小鼠体重保持稳定，表明TIBT-NCs的全身毒性可以忽略不计。在PDT治疗结束时，从每组收集的肿瘤称重并拍照，进一步证实其有效的抗癌性能。肿瘤及其他主要器官切片进行苏木精和伊红(H&E)染色。这些器官均未出现损伤或炎症病变，但TIBT-NC + L-I3组和TIBT-NC + L-I1组肿瘤明显凋亡。这表明TIBT-NCs具有良好的抗癌能力，副作用可以忽略不计。最后，对血液循环中的一些主要血液学指标进行分析。各组参数水平相似，进一步证明TIBT-NCs具有良好的体内生物相容性。这些发现有力地证实了制备的动态自组装TIBT-NCs是长效癌症治疗的有希望的候选者。
总结
不对称D-A型TIBT与对称的DTIBT相比，TIBT在固体中的PLQY值高得多，高达52.24%，尽管它们的吸收和发射光谱相似。此外，TIBT纳米聚集体的ROS生成能力远高于DTIBT。值得注意的是，TIBT NCs表现出动态自组装，其形状从初始的纳米球转变为均匀的大尺寸纳米棒，而DTIBT-NCs的形状随着时间的推移保持小尺寸球体的不变。通过自组装，纳米球和纳米棒的ROS量子产率分别从0.55提高到0.72。TIBT-NCs的动态形态变化可以在体外和体内进行，这使得TIBT-NCs具有高肿瘤靶向性，长时间的保留/积累，以及一次代谢。所有这些特点都有助于有效的PDT治疗，有效抑制肿瘤生长，抑制率为90%。这项研究表明，TIBT-NCs是一种有前途的动态自组装纳米剂，用于高性能光疗，在实际应用中显示出长期癌症治疗的巨大潜力。
参考文献
Less is More: Asymmetric D–A Type Agent to Achieve Dynamic Self-Assembled Nanoaggregates for Long-Acting Photodynamic Therapy， Ruohan Xu, Qifei Shen, Peijuan Zhang, Zhi Wang, Yanzi Xu, Lingjie Meng,* and Dongfeng Dang*，Adv. Mater. 2024, 2402434，https://doi.org/10.1002/adma.202402434
