内容提要
活性氧(Reactive oxygen species, ROS)已成为治疗肿瘤的有效工具。光动力疗法(PDT)和化学动力疗法(CDT)的结合利用了多种活性氧，提高了治疗效果。然而，CDT的活化通常发生在PDT之前，这阻碍了羟基自由基(·OH)的持续维持，降低了治疗效率。在此，我们提出了一种基于分子聚集调节的光触发纳米系统，用于将癌症治疗从PDT/光热治疗(PTT)转化为持久的CDT。有序j聚集增强了菁氨酸部分的光动力学性质，同时抑制了铜-卟啉部分的化学动力学能力。在光照射下，Cu-PCy JNPs表现出强烈的光动力和光热效应。同时，光触发菁氨酸主链的快速降解，导致J聚集的破坏。结果，一个长时间的CDT被依次激活，并且观察到持续产生·OH长达48小时，导致细胞氧化应激和凋亡。由于Cu-PCy JNPs具有良好的肿瘤蓄积性，通过转化治疗在体内表现出有效的肿瘤消融。本研究为有效延长ros肿瘤治疗的化学动力学活性提供了新的途径。
结果与讨论
Cu-PCy J聚集体的制备与表征
将七甲基菁氨酸与铜卟啉共价结合，合成了Cu-PCy，并结合了它们的功能特性，帮助调节分子聚集。花青素染料作为光敏剂和光热剂被广泛应用，其高极化率有助于形成有序的聚集体。选择铜卟啉作为CDT试剂，与花青素染料进行中位取代。铜-卟啉的空间效应显著促进了菁氨酸分子的滑动排列，促进了j聚集体的形成。此外，花青素分子的光降解特性允许通过光触发机制进行组装调制。根据前面的文献合成了菁染料(ICy)。将卟啉(TPP-OH)与铜离子(Cu2+)络合，引入到ICy的介位，生成Cu-PCy。并合成了不含Cu2+配位的卟啉菁染料(PCy)作为对照分子。
通过膜分散方法将Cu-PCy和dsc共组装，构建了Cu-PCy j聚集纳米粒子(Cu-PCy JNPs)。加入DSPE-PEG(5%)提高Cu-PCy JNPs的水溶性。扫描电镜(SEM)分析显示，Cu-PCy JNPs的平均直径在80 nm左右，尺寸分布较窄(。透射电镜(TEM)显示，Cu-PCy JNPs为多室囊泡，这可能是由dsc的两亲性组装引起的。动态光散射(DLS)监测的Cu-PCy JNPs水合半径为~90 nm，在储存一周后保持稳定。Cu-PCy JNPs表面带负电荷(8 mV)，有利于其在血液中的长时间循环。同样，PCy纳米颗粒(PCy NPs)也使用相同的方法制备，其尺寸约为80 nm。
用分光光度法研究了Cu-PCy JNPs的j聚集特性。在良好的溶剂(甲醇)中，Cu-PCy在420 nm、540 nm和780 nm处表现出三个主要的吸收峰，分别属于铜卟啉和花菁部分的Soret和Q波段。在820 nm处观察到最大的花青素发射。在水中，Cu-PCy JNPs在855 nm处出现了一个红移的锐菁吸收峰，而铜卟啉的吸收峰变化很小。计算出Cu-PCy JNPs的摩尔吸光度系数为1.16×105 L·mol -1·cm -1。Cu-PCy在820 nm处的荧光峰明显猝灭，而在920 nm处出现了一个新的荧光峰，这归因于j聚集。相比之下，甲醇中的PCy表现出与Cu-PCy相似的菁氨酸吸收和荧光峰。而在水中，PCy NPs的菁氨酸吸收峰仅发生了20 nm的红移，说明未形成j聚集。
在没有卟啉取代基的情况下，ICy纳米颗粒(ICy NPs)也不会在水中形成j -聚集体。Cu-PCy中铜离子的存在显著增强了卟啉结构的平面度和刚性，从而对j聚集中的滑动堆积形成了位阻。采用分子动力学方法模拟了Cu-PCy和dsc共组装的分子堆积模式。结果显示菁氨酸主链的滑动堆叠排列，为j聚集体的形成提供了进一步的支持。进一步测定了DSPC与Cu-PCy对j聚集的相互作用。铜- pcy JNPs的圆二色性(CD)信号显示，在410 nm左右出现正棉花效应，在430 nm左右出现负棉花效应，表明从dsc到铜- pcy的手性转移。制备Cu-PCy SelfAssemblies来验证dsc的作用。在没有dsc的情况下，没有检测到CuPCy自组装体的CD信号。DSPC脂质体具有双层膜结构，可提供疏水密闭空间，促进Cu-PCy的有序排列。然后，进一步研究不同Cu-PCy/ dsc摩尔比(1∶200 ~ 1∶5)溶液的吸收光谱，以跟踪j聚集体的形成过程。在1:20 0和1:10 0的比例下，在约800 nm处观察到宽的菁氨酸吸收峰。在1:40 ~ 1:5的摩尔比范围内，随着dsc浓度的增加，在855 nm处出现了尖锐的吸收峰。
这一现象表明，DSPC在Cu-PCy/ DSPC共组装体中起促进j聚集体形成的作用。Cu-PCy JNPs的j聚集体在较宽的浓度范围内保持稳定。即使在低浓度(0.3 μM)下，仍然可以观察到明显的j聚集特征峰。在贮藏过程中，由于花青素的光漂白作用，Cu-PCy JNPs的吸收峰和荧光峰逐渐降低。但855 nm处的吸收峰仍然很强，说明j聚集可以保持稳定性。此外，Cu-PCy JNPs在H2O2和谷胱甘肽(GSH)存在下表现出稳定性，表明Cu-PCy JNPs具有抵抗化学动力学降解的潜力。最后，测试了Cu-PCy JNPs的温度依赖性稳定性。J -聚集体在43℃以下保持稳定，但当温度超过50℃时发生破坏。这些发现表明，CuPCy JNPs在血液循环和细胞研究方面的应用是可靠的。
花青素染料的光降解特性为调控分子聚集提供了一种简单的方法。808 nm激光照射后，Cu-PCy JNPs的吸光度逐渐降低，并伴有蓝移。这一现象表明，菁氨酸的光降解导致j聚集的破坏。采用1h NMR和质谱分析了激光辐照后Cu-PCy的结构变化。在1h NMR谱中，6.4 ppm处的双键峰和4.2 ppm处与菁氨酸结构对应的季胺部分已不复存在。
从光动力/光热转化为持久的化学动力效应
评价了Cu-PCy JNPs的光动力学和光热效应，以验证其光疗潜力。我们假设由于j聚集效应和铜的重原子效应，铜- pcy JNPs的光动力效应会显著增强。为了研究这一点，我们使用Cu-PCy自组装体(含铜但不形成j聚集)和PCy NPs(不含铜也不形成j聚集)作为对照样本进行了比较研究。以1,3-二苯基异苯并呋喃(QDPBF)为探针，测定了这些纳米颗粒的1O2生成效率。在激光辐射(808 nm, 10 mW/cm2)下，Cu-PCy JNPs表现出最高的1O2生成效率。计算出Cu-PCy JNPs、Cu-PCy Self-Assemblies和PCy NPs的Φ(1O2)分别为3.7%、1.9%和0.4%。j聚集和重原子的引入都可以促进菁染料的系统间交叉，从而增加它们的光动力能力。然后，研究了Cu-PCy JNPs的光热性能。在激光辐射(808 nm, 1.0 W/cm2)下，水溶液Cu-PCy JNPs的温度在10 min内升高到56.6℃。观察到Cu-PCy JNPs的光热效应与染料浓度呈正相关，计算出Cu-PCy JNPs的光热转换效率为32.6%，与PCy NPs的28.4%相似。在三个激光照射周期中，Cu-PCy JNPs的光热加热能力逐渐下降，这与光降解特性一致。因此，光会触发PDT和PTT的“开启”过程。
其次，研究了光动力/光热效应向化学动力学效应的转化。预计在激光照射前，由于j -聚集体的紧密分子排列，Cu-PCy JNPs中的Fenton-like反应速率会受到抑制。为了证实Cu-PCy JNPs的化学动力学作用，我们用亚甲基蓝(MB)作为·OH的指示剂。在H2O2存在下，Cu-PCy JNPs产生少量·OH，在660 nm处吸收峰逐渐减小。为了激活化学动力学效应，对Cu-PCy JNPs进行激光预处理10 min，破坏j -聚集体，然后测量·OH生成速率。正如预期的那样，MB的吸光度明显加速下降，证实了化学动力学效应的增强。相比之下，不含铜离子的PCy NPs没有表现出降解MB的能力。
更重要的是，Cu-PCy JNPs显示出实现持久CDT的巨大潜力。铜卟啉复合物表现出优异的稳定性，并在光活化和化学动力学过程中保持完整。因此，与释放的游离Cu2+相比，铜的络合作用有效地抑制了类芬顿反应的速率。由于·OH固有的失活倾向，这种可控的反应速率有利于防止·OH的爆发生成。从而提高其利用效率，促进癌细胞凋亡。通过对激光照射后Cu- tpp -OH、Cu- pcy JNPs和Cu(NO3)2对MB降解的监测，验证了铜卟啉持久的·OH生成效应。通过使用Cu(NO3)2作为自由离子类芬顿试剂，观察到MB在40 min内快速降解，随后突然衰减，这表明了“·OH破裂效应”。与之形成鲜明对比的是，激光照射后的Cu-TPP-OH和Cu-PCy JNPs对MB的降解速度较慢，但持续时间超过4小时。此外，Cu-TPP-OH在实验中表现出更大程度的MB累积降解。这些结果巩固了Cu-PCy JNPs从光动力/光热效应转化为持久化学动力学效应的能力。
体外转化治疗与线粒体损伤
受Cu-PCy JNPs优异的光动力学和化学动力学特性的启发，我们对4T1细胞进行了转化治疗的效率评估。将4T1细胞分别与Cu-PCy JNPs或PCy NPs在细胞培养基中孵育4 h，然后激光照射7 min，诱导PDT和PTT。光处理后，细胞在黑暗中进一步孵育24小时，以允许CDT。采用活/死染色法评价Cu-PCy JNPs对4T1细胞的细胞毒性。在活细胞中发出绿色荧光的钙黄素AM和在死细胞中发出红色荧光的碘化丙啶被用来观察细胞。如图5A所示，用Cu-PCy JNPs处理的细胞在激光照射下表现出细胞活力的显著下降，而单独使用PCy NPs只导致大约一半的细胞死亡。随后，使用CCK-8法定量评估细胞杀伤效率。在激光照射和持久的化学动力学作用下，Cu-PCy JNPs导致超过80%的4T1细胞死亡。
线粒体对活性氧高度敏感。线粒体内ROS的积累可导致线粒体膜、DNA和蛋白质的损伤，最终导致线粒体功能障碍和癌细胞凋亡。[20]基于Cu-PCy JNPs出色的线粒体靶向能力，进一步评估其诱导线粒体损伤的潜力。选择商业探针JC-1作为线粒体状态的指示器。转换治疗组用Cu-PCy JNPs培养4T1细胞，激光照射7 min，再孵育12 h后，用JC-1染色。观察到较强的绿色荧光和较弱的红色荧光，表明Cu-PCy JNPs引起线粒体损伤。在光治疗组中，PCy NPs暴露于激光照射也导致一定程度的线粒体损伤。相反，在对照组(磷酸盐缓冲盐水(PBS)、PBS+L、Cu-PCy JNPs和PCy NPs)中，相反的荧光信号强度表明线粒体膜未受影响。因此，Cu-PCy JNPs通过将光疗转化为CDT诱导线粒体损伤，显示出强大的细胞杀伤能力。
体内荧光成像与治疗
在异种移植的4T1荷瘤小鼠中评估了Cu-PCy JNPs的体内肿瘤蓄积。静脉注射Cu-PCy JNPs (200 μL, 100 μM)后，肿瘤部位荧光信号强度迅速增加，并在注射后24 h达到最大值。48 h后，Cu-PCy JNPs的荧光信号仍可检测到，这表明它们在肿瘤部位停留了很长时间，这支持了更持久的CDT。然后，研究Cu-PCy JNPs的血液循环，监测代谢。注射后10min，血中荧光信号强度达到最大值。然后，荧光信号迅速衰减，半衰期为1 h。通过监测24 h荧光信号，观察Cu-PCy JNPs在肿瘤及心、肝、脾、肺、肾等主要器官中的生物分布。在肝脏、脾脏和肿瘤部位观察到Cu-PCy JNPs的强荧光信号。在肝脏和脾脏的积聚可能归因于两性离子DSPC和DSPE-PEG成分。此外，PCy NPs也表现出一定程度的肿瘤蓄积，在24-48 h时信号较强。因此，我们认为注射后24 h为肿瘤治疗的最佳时间。采用异种移植的4T1荷瘤小鼠进一步研究了Cu-PCy JNPs的体内转化治疗。将小鼠分为PBS、PBS+激光、PCy NPs、Cu-PCy JNPs、PCy NPs+激光、Cu-PCy JNPs+激光6组。根据体内荧光成像结果指导激光照射进行光疗。808 nm激光(1.0 W/cm2)照射10 min后，肿瘤温度升高至49.4℃，而“PCy NPs+激光”组达到46.1℃，相应的，肿瘤部位荧光信号明显减弱，表明j聚集和治疗转化被破坏。治疗后16天，通过监测各组肿瘤体积来评估体内抗肿瘤疗效。“Cu-PCy JNPs+激光”组肿瘤完全消除。“PCy NPs+激光”组对肿瘤的抑制作用较“Cu-PCy JNPs+激光”组弱。治疗结束时小鼠的肿瘤照片也支持相同的结论。其他对照组(PBS、PBS+激光、PCy NPs和Cu-PCy JNPs)肿瘤体积增长较快。此外，各组小鼠体重在16天内均无明显变化，说明PCy NPs和Cu-PCy JNPs具有良好的生物安全性。对肿瘤组织进行组织学苏木精和伊红(H&E)染色，进一步评价治疗效果。“CuPCy JNPs+激光”组显示出最严重的坏死组织和肿瘤细胞凋亡，显示了转换治疗的良好治疗效果。
总结
已经证明了一种光触发转换癌症治疗的新策略，从PDT/PTT到长效CDT。在光照射下，Cu-PCy JNPs中花青素染料j聚集的形成和破坏促进了转化治疗。这种方法战略性地调节了fenton样反应速率，使ROS的产生得到抑制，随后通过光疗激活CDT，并延长·OH的生成。·OH的存在可以在激活后48小时内检测到，这有助于通过诱导氧化应激增强对癌细胞的细胞毒性。体外转化疗法表明，通过线粒体靶向和破坏线粒体功能，可以有效杀死4T1细胞。在体内荧光成像的引导下，Cu-PCy JNPs通过转化治疗有效地根除肿瘤。这项工作提出了一种安全有效的策略来延长基于ROS的治疗效果。
参考文献
A Light-Triggered J-Aggregation-Regulated Therapy Conversion: from Photodynamic/Photothermal Therapy to Long-Lasting Chemodynamic Therapy for Effective Tumor Ablation ，Kai Wei, Yanxin Wu, Xian Zheng, Li Ouyang, Guiping Ma, Chendong Ji*,and Meizhen Yin*,Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202404395，doi.org/10.1002/anie.202404395
