内容提要
光驱动癌症治疗以其疗效高、可控性强、无创性强的特点，显示出了不竭而旺盛的生命力。探索一种同时提供多模态诊断成像和协同光疗的全方位治疗材料将是一项具有吸引力但具有重大挑战性的任务。本研究将预先带1O2电荷的两亲性聚合物与定制的Ir(III)配合物IrDPTP巧妙整合，构建了一种新型纳米药物Ir@PPEG-MeEPO，该纳米药物具有二次近红外(NIR-II)聚集诱导发射(AIE)倾向、高效的活性氧(ROS)生成、良好的光热转化效率和高效的产氢性能。据我们所知，在所有报道的AIE Ir (III)配合物中，IrDPTP具有最长的发射波长。此外，Ir@PPEG-MeEPO在近红外照射下能够通过触发光热效应可控地释放ROS，很好地适应肿瘤缺氧环境。这些独特的特点使Ir@PPEG-MeEPO在NIR-II荧光-光声-光热三模成像和光动力-光热-氢三模治疗的六种治疗方法上有着前所未有的表现，可以精确诊断肿瘤，完全消除肿瘤。该研究将为探索用于实际癌症治疗的优质纳米医学开辟新的视角。
结果与讨论
IrDPTP和Ir@PPEGMeEPO的设计与合成
采用D-A-D结构作为辅助配体(DPTP)，由二吡啶[3,2-a:2 '，3 ' -c][1,2,5]噻二唑[3,4-i]吩那嗪和四苯基乙烷(TPE)单元组合而成。此外，在TPE组分中加入3-(甲氧基甲基)庚烷侧链，增加了立体阻塞，从而获得了更好的AIE性能和溶解度。以往对内过氧化物的研究表明，萘和2-吡啶酮官能化的位置对内过氧化物释放1O2的效率和温度起着至关重要的作用。因此，选择1,4-二甲基萘、2-吡啶酮和3-甲基-2-吡啶酮作为候选物，并根据它们对应的内过氧化物分解效率和温度进行比较。考虑到37°C与体温接近，因此选择40°C可以使热诱导释放的1o2产率达到最佳，且不会对正常组织造成损伤。随后，在不同温度下的1O2测定显示，3甲基-2-吡啶酮产生的内过氧化物比其他两组具有更高的单线态氧。因此，可以选择基于3-甲基-2-吡啶酮的聚合物作为有效的1O2载体，以便在选定的温度下递送1O2。为了提高聚合物的水溶性，适当的PEG改性可以形成两亲性聚合物。聚异丁烯-马来酸酐(PMA)与3 -甲基-2-吡啶酮和聚乙二醇(PEG)通过1O2的环加成制得内过氧化物负载聚合物(PEG- meepo)。然后使用PPEGMeEPO通过纳米沉积方法将IrDPTP封装到纳米颗粒Ir@PPEG-MeEPO中。以不含3-甲基-2-吡啶酮的PEG聚合物包封IrDPTP形成的Ir@PPEG为对照。
光物理性质的研究
研究了DPTP、IrDPTP和Ir@PPEGMeEPO的光物理性质。首先记录了DPTP和IrDPTP的吸收和发射情况。从DPTP和IrDPTP的最大吸收峰分别位于593 nm和633 nm处，可以清楚地看到铱原子的引入引起了明显的红移。同样，与DPTP相比，IrDPTP的发射峰表现出明显的红移。对Ir@PPEGMeEPO的吸收和发射也进行了分析。Ir@PPEG-MeEPO的最大吸收峰和最大发射峰分别位于663 nm和1058 nm处，表明其具有较深的组织穿透深度。Ir@PPEG-MeEPO表现出很大的斯托克斯位移，这减少了来自背景荧光和其他吸收化合物的干扰，使其对生物成像更敏感。然后，探讨了DPTP和IrDPTP的聚合状态。将四氢呋喃作为两种化合物的良好溶剂加入到正己烷溶液中。它们的荧光强度随着己烷量的增加而增加，这可归因于典型的AIE效应。利用动态光散射(DLS)测定Ir@PPEG-MeEPO的粒径，发现其平均水动力粒径约为68 nm。同时，Ir@PPEG-MeEPO的透射电镜(TEM)成像表明，颗粒呈球形，平均直径为20 nm。更重要的是，DLS实验表明，纳米颗粒在磷酸盐缓冲盐水(PBS)和PBS加10% FBS中保持稳定至少7天。另外，用亚甲基蓝铂(MB-Pt)试剂验证氢气的生成，在Pt的催化下，MB可以被氢还原。在IrDPTP加近红外照射下，MB的特征峰急剧降低，颜色逐渐褪色，同时产生大量气泡。气相色谱(GC)进一步证实了IrDPTP产生氢的能力。近红外照射后，收集IrDTPP产生的氢气进行气相色谱测定。正如预期的那样，在IrDPTP中，产氢量随着近红外曝光时间的增加而增加。这些结果清楚地证明了IrDPTP产生氢的能力。此外，对Ir@PPEG-MeEPO的光热转换能力进行了研究，近红外激光以10、50、100、200、300 μM的浓度照射后，其溶液温度分别提高了2.7℃、9.7℃、17.9℃、24.4℃、34.3℃，表明Ir@PPEG-MeEPO具有良好的光热效应。
光和热触发ROS的产生
进一步研究了光动力效率。非荧光探针2′，7′二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)在ROS存在下可转化为高荧光二氯荧光素(DCF)。DCFH-DA氧化后的DCF的绿色荧光强度随着660 nm激光照射时间的延长而迅速增加。经过660 nm激光照射10 min后，与IrDPTP孵育的DCF荧光强度增加了~75倍，表明其产生ROS的能力比DPTP(~9倍)更强。IrDPTP优异的光动力治疗能力主要是由于重原子作用产生的ISC增强所致。以9,10-蒽二基双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)为1O2探针，研究了1O2生成的性能评价。值得注意的是，在660 nm激光照射下，IrDPTP诱导ABDA的吸收带明显下降，而DPTP存在时吸光度的下降可以忽略不计。
根据ABDA吸收衰减图可以明显看出，在IrDPTP存在下，在660 nm照射10 min后，ABDA的吸光度强度下降了30%。相比之下，在相同的条件下，经DPTP处理的ABDA的吸光度强度没有明显下降。由此可见，IrDPTP具有更优异的PDT效果。以商用PDT试剂吲哚菁绿(ICG)为对照品，评价了IrDPTP作为光敏剂的性能。IrDPTP处理DCF的荧光强度增强约62倍，明显高于同等条件下ICG处理DCF的荧光强度(约14倍)。此外，利用超氧阴离子(O2−•)指示剂二氢霍达明123 (DHR123)和羟基自由基(•OH)指示剂羟基苯基荧光素(HPF)对IrDPTP产生的其他ROS进行了分析，鉴定出它们经历了I型光化学过程。在660 nm激光照射下，IrDPTP存在时，DHR123和HPF的荧光明显增强，表明其具有较强的O2−•和•OH生成能力。这促使我们进一步研究IrDPTP在体内的PDT，因为它具有出色的ROS生产能力。
通过监测DCF的发射谱和ABDA的吸收光谱，分析了Ir@PPEG-MeEPO的1O2释放能力。在没有光的情况下，Ir@PPEG-MeEPO诱导的DCF的荧光强度随着加热温度的提高而逐渐增强。相反，Ir@PPEG未检测到明显的荧光信号。此外，ABDA进一步检测了热诱导1O2的生成。随着加热时间的延长，ABDA的吸收峰逐渐减小，同时1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF, 1O2探针)也出现了同样的吸收漂白现象。热活化1O2生成结果显示，随着温度升高，检测到的1O2增多。这可以用以下事实来解释:Ir@PPEG-MeEPO由于内过氧化物的存在，可以在不暴露于光的情况下释放1O2。
研究了Ir@PPEG-MeEPO在氮环境光刺激下的ROS生产能力。在660 nm激光照射下，Ir@PPEG-MeEPO诱导的DCF荧光强度迅速增强，而Ir@PPEG的荧光强度仍然很低。
为了进一步验证Ir@PPEG-MeEPO光触发生成1o2的能力，我们利用ABDA对1O2进行了研究。值得注意的是，与ABDA在10分钟内消耗不完全的Ir@PPEG相比，在近红外照射周期内，负载过氧化物的Ir@PPEG-MeEPO在1分钟内检测到大量的1O2生成。由于使用了可再生的1O2载体，在相同的实验条件下，Ir@PPEG-MeEPO产生的1O2水平比小分子IrDPTP高。
接下来，研究了Ir@PPEG-MeEPO在光暗交替条件下产生1O2的情况，表明在光或热条件下1O2都能持续生长。在不同条件下监测ABDA恶化情况。在不光照的情况下，Ir@PPEGMeEPO诱导的ABDA吸收率在50℃时下降明显，且随加热的持续下降。此外，在近红外照射150 s后，Ir@PPEG-MeEPO处理的ABDA在没有照射的30分钟内继续随时间衰减。这可归因于Ir@PPEG-MeEPO的多作用机制，包括热刺激释放1O2和光敏化产生1O2。停止辐照暴露后，ABDA的吸收值在黑暗中持续下降一段时间。光热联合刺激更有效地促进了1O2的生成。
常氧和低氧条件下的光细胞毒性研究
在黑暗和660 nm照射下进一步研究Ir@PPEG-MeEPO对4T1细胞活力的影响。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)为基础，在常氧(21% O2)和缺氧(<1% O2)条件下测定Ir@PPEGMeEPO对4T1细胞的细胞毒作用。结果表明，在常氧条件下，Ir@PPEG-MeEPO在黑暗中表现出较低的细胞毒(IC50>100 μg/mL)。它的光毒性在常氧环境中被发现是非常高的，并且Ir@PPEG-MeEPO即使在缺氧条件下也保持高度的光毒性。光毒性指数(PI)，即在黑暗中与在光照下的IC50之比，在Ir@PPEG-MeEPO中计算为209.5，表明其作为优越的光疗剂的功效。值得注意的是，即使在缺氧环境下，与缺乏1个O2载体的Ir@PPEG相比，负载1个O2载体的Ir@PPEG-MeEPO也表现出显著的PI升高。综上所述，这些结果表明Ir@PPEG-MeEPO在缺氧条件下保持了显著的治疗效果。这主要归因于Ir@PPEG-MeEPO的多作用机制，通过无限制的氧浓度、热量和氢释放高细胞毒性的1O2加上近红外照射。
体外缺氧条件下ROS的生成及细胞凋亡的评价
受这些结果的鼓舞，我们研究了潜在的生物学机制的作用。为了验证Ir@PPEG-MeEPO在缺氧条件下作为ROS发生器的能力，我们用ROS探针诱导4T1细胞，然后在常氧或缺氧条件下在660 nm照射3 min，然后进行成像检测。当ROS存在时，在缺氧条件下使用激光扫描共聚焦显微镜监测亮绿色荧光DCF。正如预期的那样，检测到突出的绿色荧光信号，表明Ir@PPEG-MeEPO能够在缺氧条件下以非常高的速率产生ROS。相反，在相同条件下Ir@PPEG存在时，荧光较弱。这些结果表明Ir@PPEG-MeEPO在缺氧条件下可以有效地产生ROS。
同时，利用钙黄素- am /碘化钠对揭示细胞死亡机制。用Ir@PPEG-MeEPO处理4T1细胞后，照射后检测到大量凋亡细胞，而在黑暗中几乎未检测到细胞死亡。为了进一步证实Ir@PPEG-MeEPO对缺氧条件下细胞死亡的影响，在缺氧条件下也进行了相同的程序。辐照后，在缺氧条件下，Ir@PPEG-MeEPO处理的细胞死亡率仍然很高，而在Ir@PPEG中只有一小部分凋亡细胞。由此可见，Ir@PPEG-MeEPO可缓解缺氧压力，保持良好的治疗效果。活/死实验与MTT实验相吻合，证明了结论的可行性。
研究表明，氢可以抑制癌细胞的线粒体功能，从而阻断能量供应。以Ir@PPEG-MeEPO产氢为基础，采用JC-1指标考察氢气对线粒体膜电位(MMP)的影响。MMP在维持线粒体氧化磷酸化、产生ATP、具有线粒体功能等方面发挥着不可或缺的作用。MMP崩溃后，JC-1处理细胞的荧光由红色变为绿色，表明线粒体功能障碍。在黑暗中检测到红色荧光读数，表明线粒体的完整性。照射后观察到绿色荧光信号，表明MMP降低。同时，Ir@PPEG-MeEPO + NIR辐照处理的细胞内ATP量明显低于空白组，说明氢气能够通过抑制线粒体功能障碍和ATP生成来杀死癌细胞。此外，Ir@PPEG-MeEPO组在ATP方面比Ir@PPEG组更有效，这可能是因为ROS和氢的协同作用通过降低MMP水平和减少ATP的产生来破坏癌细胞的增殖。
体内成像和治疗研究
多功能影像诊断试剂的发展有利于肿瘤的诊断和精准治疗。为了研究纳米颗粒在体内的荧光成像和在肿瘤中的积累能力，将Ir@PPEGMeEPO静脉注射到4T1荷瘤小鼠体内。在注射Ir@PPEG-MeEPO后的不同时期捕捉小鼠的荧光图像。随着注射时间的延长，肿瘤部位的荧光信号逐渐增强，在注射后1小时达到峰值。考虑到Ir@PPEG-MeEPO高达870 nm的吸收，选择808 nm激光进行NIR-II荧光成像。成像结果与660 nm激光成像结果一致。总的来说，这些发现表明Ir@PPEG-MeEPO具有更好的肿瘤靶向能力。可以明显看出，注射后12 h荧光强度可以忽略不计，说明Ir@PPEG-MeEPO在肿瘤中代谢迅速。考虑到Ir@PPEGMeEPO具有良好的光热效应，我们也采用相同的方法研究了其对体内PA信号的能力。注射后(1 h)监测肿瘤部位PA信号达到峰值。其次，肿瘤部位的信号范围随着时间的推移而减小，同时PA强度降低。值得注意的是，肿瘤区域PA强度变化趋势与NIR-II FLI结果一致，提示注射药物后1小时为治疗肿瘤的最佳时间。PAI结合NIR-II FLI的穿透深度更深，可以在更深层次上观察肿瘤组织的轮廓，实现对肿瘤多方向的实时诊断。
受这些体外实验结果的鼓舞，我们进一步研究了Ir@PPEG-MeEPO在体内的治疗效果。为了评价光热效果，4T1荷瘤小鼠分别注射PBS和Ir@PEG作为对照组，Ir@PPEG-MeEPO作为对照组。静脉注射1小时后，将小鼠置于黑暗中或暴露于660 nm激光照射下。显然，PBS组的温度在660 nm激光照射下仍有轻微变化。在Ir@PPEG组中，在相同条件下，温度升高了近16°C。Ir@PPEG-MeEPO处理小鼠肿瘤部位温度缓慢上升至51℃。将4T1荷瘤小鼠随机分为5组进行不同治疗。在两周内每两天对所有小鼠的肿瘤体积和体重进行跟踪。令人欣慰的是，每只小鼠表现正常，没有压力或不适的迹象，也没有体重减轻，表明Ir@PPEG-MeEPO具有良好的生物相容性。虽然Ir@PPEG治疗显示肿瘤体积减小，但治疗两周后仍有一小部分肿瘤体积保留并继续扩大。相反，用Ir@PPEG-MeEPO治疗的肿瘤被发现可以被根除。注射14天后对肿瘤和小鼠进行拍照和记录。Ir@PPEG-MeEPO治疗后肿瘤完全消除，无复发。治疗结束后，采用苏木精-伊红(H&E)染色对肿瘤组织进行组织学检查。Ir@PPEG-MeEPO组和Ir@PPEG组肿瘤组织经照射后出现明显病变，包括染色凝集和核凝集。此外，为了进一步研究Ir@PPEGMeEPO的肿瘤杀伤机制，我们对末端脱氧核苷酸转移酶dUTP nick end labeling (TUNEL)和血小板内皮细胞粘附分子-1 (CD31)进行了研究。TUNEL免疫荧光染色显示，与对照组小鼠相比，Ir@PPEG-MeEPO + 660 nm激光照射小鼠肿瘤组织中凋亡阳性细胞大量生长。经Ir@PPEG-MeEPO治疗后的肿瘤组织中cd31阳性血管的形成明显受到抑制，而PBS组中有许多新生血管。研究表明，氢是实体瘤中调节免疫微环境的主导因子，可抑制肿瘤中血管内皮生长因子的表达，引发免疫应答。因此，通过4T1荷瘤小鼠评估Ir@PPEG-MeEPO-induced抗肿瘤免疫应答。，与PBS组(CD45+)相比，Ir@PPEG-MeEPO组的肿瘤表现出明显增强的免疫应答。总之，本研究表明Ir@PPEG-MeEPO在协同PDT/PTT/氢气处理方面具有巨大的潜力。
系统地研究了Ir@PPEG-MeEPO的体内长期安全性。小鼠注射Ir@PPEG-MeEPO (10 mg kg−1200 μL)。14 d后，取主要脏器进行H&E染色，分析肝肾功能生化指标。与对照组相比，各项指标正常。Ir@PPEGMeEPO治疗后各脏器未见明显组织学异常。另外，在14天的治疗结束时，处死小鼠，收集所有小鼠的血清进行生化分析。实验结果显示，所有小鼠的肝肾功能均在正常范围内。结果表明，Ir@PPEG-MeEPO具有良好的生物安全性和体内生物相容性，可广泛应用于FLI/PAI/PTI指导下的PDT/PTT/氢疗法联合治疗平台。
总结
综上所述，我们设计并构建了一种新型的AIE活性Ir(III)配合物IrDPTP，由于铱原子的存在，该配合物具有高ROS生成能力，高效产氢和NIR-II发射能力。据我们所知，在所有报道的AIE Ir(III)配合物中，IrDPTP具有最长的发射波长(1058 nm)。然后将IrDPTP包封在内过氧化物功能化的两亲性聚合物中形成Ir@PPEG- MeEPO，实现1O2的储存和热控释放。Ir@PPEG-MeEPO被证明可以通过使用内过氧化物有效地促进ROS的生成，特别是在缺氧情况下。此外，Ir@PPEG-MeEPO会产生氢气，导致MMP减少，影响ATP的合成，破坏氧化还原平衡，杀死肿瘤细胞。体内实验表明，通过PDT/PTT/氢协同治疗，Ir@PPEGMeEPO在肿瘤部位迅速积累并消灭肿瘤。多模态成像引导光热触发氧不依赖疗法为缺氧肿瘤的治疗开辟了新的途径。
参考文献
Light-driven sextuple theranostics: nanomedicine involving second near-infrared AIE-active Ir(III) complex for prominent cancer treatment， Xue Liu, Jiangao Li , Fei Zhang , Dingyuan Yan , Lei Wang , Dong Wang* & Ben Zhong Tang*,Sci China Chem,https://doi.org/10.1007/s11426-024-2086-8
