内容提要
共价有机框架(COFs)虽然被用作光动力治疗的光敏剂，但由于激发/发射波长短，无法在体内进行精确的荧光成像和在深层组织中进行光疗。本工作提出了第一个NIR-II发射和苯并双噻二唑基COF(COF-980)。与其配体相比，COF-980的结构可以更有效地减小激发态与三重态之间的能隙(∆ES1-T1)，从而提高光动力治疗效率。而且，COF-980具有高的光稳定性，良好的抗扩散性能，优越的活性氧(ROS)生成效率，良好的成像能力，以及在深层组织(≈8 mm)产生ROS的能力。COF-980联合激光照射可引发更大量的细胞内ROS，从而高效诱导癌细胞死亡。值得注意的是，COF-980 NPs精确地实现了NIR-II荧光成像引导的PDT，有效地抑制了4T1肿瘤的生长。该研究为开发长波发射COFs提供了一种通用的方法，并开发了其在生物医学上的应用。
结果与讨论
COF-980的合成与表征
为了实现COF的NIR-II发射，我们采用了一种简单的方法制备了醛功能化苯二噻唑荧光基团作为配体(L-BBTD)。 L-BBTD具有NIR-II发射行为和优异的光稳定性。通过L-BBTD与氨基取代的TAPP缩合合成了COF-980。在获得COF-980后，我们进行了模拟试验和x射线衍射(XRD)来阐明其结构和单元胞参数。仿真结果表明，COF-980倾向于采用交错AA叠加模型。COF-980的高结晶度在PXRD光谱中有清晰的峰，在4.47°和5.16°处观察到两个尖锐的衍射峰。Pawley精化剖面与实验观测图样吻合良好，一致性系数较高(Rwp = 5.29%， Rp = 3.83%)。通过N2吸附等温线评估COF-980的孔隙体积，计算出COF-980的Brunauer-Emmett - Teller (BET)表面积为1160 m2 g−1。通过核磁共振在160 ppm处出现一个峰，x射线光电子能谱在398.2 eV处出现一个峰，红外光谱在1620 cm−1处出现一个峰，证实了亚胺键的成功构建。随后，通过扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)检查COF 980的形貌，发现COF 980具有均匀有序的层状结构。最后，单个COF-980中C、N和S的元素映射呈现几何和成分分布。这些结果表明，通过L-BBTD和TAPP构建块的共价连接成功构建了COF-980。
COF-980的光物理性质及ROS产生
在808 nm激发下，COF-980在DMF溶液中显示出980 nm左右的最大发射，可用于深部组织成像和光疗。此外，COF-980表现出较高的摩尔消光系数，有利于在特定波长下获得强吸收能力。此外，COF-980在1000 nm和1100 nm LP滤波器下均表现出优异的NIR-II信号。通过计算，COF-980的HOMO/LUMO比其配体L-BBTD (1.4096 eV)和TAPP (1.7487 eV)具有更低的能带隙(Egap = 0.7524 eV)COF-980清楚地区分了HOMO和LUMO。结果表明，L-BBTD配体受体苯并双噻唑支架对COF-980单元的LUMO贡献较大，而COF-980的HOMO水平主要位于TAPP支架上。由于胺和醛产生的亚胺官能团在COF-980结构中以有序的方式放置，有助于缺电子的苯并噻唑和富电子的三苯胺之间的电荷转移过程，这一差距缩小了。
为了监测ROS的产生，我们使用了一种荧光指示剂(2 '，7 ' -二氯二氢荧光素二乙酸酯，DCFH-DA)。DCFH-DA在ROS存在下可以快速氧化，从而产生一种可检测的荧光物质，称为二氯荧光素(DCF)。在808 nm激光照射下，COF980对DCFH荧光的增强因子(8倍)高于配体L-BBTD(4倍)。为了揭示COF-980在激光照射下引发的活性氧类型，我们采用1O2指示剂(1,3- diphenylisoobenzofuran, DPBF)来评估COF-980产生的1O2。在照射下，COF-980存在时，DPBF在415 nm处的吸光度明显下降，而配体L-BBTD的吸光度保持相对不变。结果表明，COF-980在808 nm激光下可以有效地产生1O2。同时，亚甲基蓝(MB)也被用于检测羟基自由基(•OH)，在665 nm处，MB的吸收强度明显降低。此外，我们还利用电子顺磁共振(EPR)光谱对COF-980产生的ROS种类进行了评估，并使用了1O2捕集剂(2,2,6,6 -四甲基-4-哌啶酮盐酸盐，TEMP)。正如预期的那样，清晰地观察到1:1:1 (1O2)的特征三线ESR信号谱，这表明COF980可以有效地产生1O2。此外，COF-980在连续激光照射下表现出良好的光稳定性。最后，在组织模拟中评估COF980的光学和ROS穿透性。与配体L-BBTD相比，COF-980表现出更明显的NIR-II荧光信号和穿透深度(增加到8 mm)。同时，COF-980产生的ROS即使在8 mm深度也能被检测到。根据计算，COF-980与其配体LBBTD (1.0067 eV)和TAPP (1.0446 eV)相比，具有较大的lowerΔEST (0.4294 eV)。这一结果也验证了COF-980与其配体相比具有更高的ROS生成效率。
体外抗肿瘤活性
COF-980在90min内扩散面积基本保持不变，说明COF-980具有良好的抗扩散性能。同时，对COF-980在生理环境中的稳定性进行了评价。在胎牛血清(FBS)中，COF980的吸收在6天内几乎没有变化，表明在生物条件下具有良好的稳定性。随后探讨COF-980的细胞成像能力。与COF-980孵育24 h后，小鼠乳腺癌4T1细胞显示出明亮的NIR-II荧光信号，且随COF-980浓度的增加而增强。然后用MTT法测定cof -980对4T1细胞的PDT效率。不同浓度COF980孵育24 h后，将4T1细胞暴露于808 nm (1.0 W cm−2.5 min)的激光照射下，再孵育24 h。MTT结果显示，COF980对激光照射下的细胞具有剂量依赖性的细胞毒性。相比之下，未经激光处理的COF-980孵育的细胞未观察到明显的细胞毒性。钙黄蛋白乙酰氧基甲酯(Calcein AM)/碘化丙啶(PI)活/死细胞染色实验进一步证实了COF-980的PDT效率。激光照射和COF-980处理均不能杀死细胞，而COF-980 (100 μg mL−1)与激光照射同时处理对肿瘤细胞造成严重损伤，诱导细胞死亡。同时用DCFH-DA染色检测细胞内ROS的生成。与激光照射或单独使用COF-980处理的细胞相比，COF-980 +激光照射的细胞显示出更亮的绿色荧光，这表明细胞内产生了更多的ROS氧化DCFH-DA去乙酰化产物而发出绿色荧光。这些结果证实了COF-980对肿瘤细胞具有良好的PDT作用，具有应用于肿瘤体内PDT的潜力。
体内NIR-II生物成像和PDT
为了进一步促进体内应用，我们将COF-980加载到两亲性的DSPE-mPEG5000中，得到了封装效率为94.9%的COF-980 NPs。包封后，COF-980 NPs表现出吸收和发射的特性，这与游离COF-980的行为一致。此外，动态光散射结果表明，COF-980 NPs在水中的平均直径为≈230 nm，透射电子显微镜(TEM)成像的尺寸为≈160 nm。我们进一步研究了COF-980 NPs在808 nm照射下产生的1O2和ROS。COF-980 NPs的1O2生成能力通过吸收光谱的显著降低得到进一步证实。测量了COF-980 NPs的ROS生成，结果表明其具有出色的ROS生成能力。
接下来，我们对携带4T1肿瘤的Balb/c小鼠进行NIR-II成像。经静脉注射COF-980 NPs后，COF-980 NPs的荧光信号逐渐增强，直至36 h，注射后72 h仍保持较强的荧光信号，说明COF-980 NPs具有高效的肿瘤蓄积作用。注射后36 h，肿瘤部位的荧光强度略有下降，但到72 h仍能清晰地分辨肿瘤边缘，提示COF-980 NPs在肿瘤部位有良好的保留。因此，COF-980 NPs的最大肿瘤蓄积时间点为36 h。注射后36 h，我们还观察了COF-980 NPs在肿瘤和其他主要器官中的生物分布。NIR-II荧光图像进一步显示COF-980 NPs在肿瘤内成功积累，且在肝脏和脾脏有高浓度分布。
受COF-980 NPs体外抗肿瘤作用的启发，我们评估了COF-980 NPs对携带4T1肿瘤的Balb/c小鼠的体内抗肿瘤能力。肿瘤平均体积≈60 mm3后开始治疗。我们将所有小鼠随机分为四组(n = 3):(i) PBS，(ii) PBS +激光照射，(iii) COF980 NPs， (iv) COF-980 NPs +激光照射。小鼠静脉注射COF-980 NPs (0.5 mg mL−1,200 μL)或PBS 36 h后，分别进行808 nm激光或不激光治疗。我们每3天监测15天内的肿瘤体积。COF-980 NPs +照射治疗显著抑制肿瘤生长，而其他组肿瘤抑制作用可忽略不计。肿瘤大小照片直观显示，COF-980 NPs +激光照射治疗显著抑制肿瘤生长，而其余组肿瘤迅速增大。结果表明COF-980 NPs具有明显的光动力治疗作用。在治疗过程中，所有小鼠的体重都没有明显下降，这意味着治疗的副作用很小。为了进一步评价治疗效果，记录4T1模型在不同治疗后的生存时间。COF-980NPs +激光照射可使小鼠存活时间延长至45天以上。此外，注射COF-980 NPs后15天收获的肿瘤组织的苏木精和伊红(H&E)染色显示，对照组保持正常形态。进一步的主要器官(心、肝、脾、肺和肾)的H&E分析显示，所有试验组的损伤都可以忽略不计，表明COF-980 NPs在PDT癌症治疗中具有良好的生物安全性。
总结
我们提出了一种基于苯并双噻二唑支架的新型NIR-II发射COF-980。在生物条件下，COF-980具有良好的光稳定性和化学稳定性。COF-980在深层组织(≈8 mm)中也表现出良好的成像和ROS生成能力。重要的是，COF-980对4T1癌细胞具有良好的体外PDT作用。较长的发射波长带来了高性能的体内图像，这也指导了高效的PDT治疗4T1肿瘤，副作用最小。该研究可能会启发进一步研究NIR-II发射cof基生物医学应用药物。
参考文献
Rationally Designed Benzobisthiadiazole-Based Covalent Organic Framework for High-Performance NIR-II Fluorescence Imaging-Guided Photodynamic Therapy, Xian Zhang, You Dou, Shuang Liu, Peiyao Chen, Yating Wen, Junrong Li, Yao Sun,* and Ruiping Zhang*, Adv. Healthcare Mater. 2024, 2303842，https://doi.org/10.1002/adhm.202303842
