内容提要
实体肿瘤的缺氧微环境严重降低了氧依赖光动力治疗(PDT)的疗效。开发耐缺氧光敏剂用于PDT是一个迫切的要求。在这项研究中，一种新的铼配合物(Re-TTPY)开发了一种基于pdt诱导的铁死亡和免疫治疗的“闭环”治疗。Re-TTPY由于其电子供体-受体(D-A)结构，在550 nm光照射下经历了能量转移和电子转移过程，表现出耐缺氧I/II型组合PDT能力，可以同时生成1O2、O2−和·OH。此外，活性氧(ROSs)导致1,4-二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)和谷胱甘肽(GSH)的耗竭。因此，铁死亡发生在细胞中，同时引发免疫原性细胞死亡(ICD)，并促进树突状细胞(dc)的成熟和T细胞的浸润。CD8+ T细胞释放干扰素-γ下调GPX4的表达，进一步增强铁死亡的发生，从而形成一个相互加强的“闭环”治疗途径。
结果与讨论
Re-TTPY和TTPY配体的详细合成过程见方案S1。它们通过1H NMR, ESI-MS和13C NMR谱完全表征。HPLC分析Re-TTPY纯度为96.7%。由于强烈的分子内D-A相互作用，Re-TTPY在400-700 nm范围内比Re-Cl和TTPY表现出强烈的红移吸收。Re-TTPY表现出更高的摩尔消光系数((Re-TTPY, 550 nm) = 16 614.8 m−1cm−1，。为了研究配合物的电子性质，使用Gauss 09程序进行了密度泛函理论(DFT)和时变密度泛函理论(TD-DFT)计算.与TTPY相比，Re-TTPY的最低未占据分子轨道(LUMO)水平降低，Re-TTPY的最高已占据分子轨道(HOMO)水平升高。因此，ReTTPY的能隙(2.07 eV)小于TTPY的能隙(2.17 eV)，这是Re-TTPY相对于TTPY的吸收红移的原因。此外，Re-TTPY在650-800 nm范围内显示近红外发射，与TTPY相比有明显的红移。
为了研究ReTTPY在聚集体状态下的光致发光特性，检测了不同水分数的THF/H2O混合物中的光致发光光谱。Re-TTPY的发射强度随着含水量从0%增加到70%而降低，并伴有发射红移，表明由于分子内电荷转移(twisted intral charge transfer, TICT)特性，Re-TTPY存在明显的溶剂化效应。然而，当含水量从70%增加到90%时，Re-TTPY的最大发射量红移，PL强度大大增强，表明Re-TTPY具有AIE活性。通过在不同极性溶剂中的吸收光谱和发射光谱来研究其TICT性能。Re-TTPY在不同溶剂中的主要吸收范围在450-600 nm之间，在极性较强的溶剂如甲醇和二甲亚砜中表现出非常弱的发射强度，与极性较弱的溶剂如二氯甲烷形成鲜明对比。这进一步说明Re-TTPY具有较强的TICT特征。由于细胞培养基均为水性溶剂，在细胞水平上是聚合态。我们使用TEM分别测试了0%和90%含水量时Re-TTPY的粒径分布。结果表明，Re-TTPY在细胞环境中以聚集形式存在。
采用紫外可见吸收光谱法测定了Re-TTPY在1640介质中的稳定性。在24 h内，Re-TTPY的吸收没有变化。结果表明，Re-TTPY在1640介质中表现出良好的稳定性。此外，羰基金属配合物在外界刺激下也能释放CO。采用血红蛋白(Hb)法考察光照下Re-TTPY是否能释放CO。在550nm的绿光照射下，Hb溶液在Re-TTPY存在下的紫外-可见吸收没有变化。此外，通过HPLC分析，Re-TTPY在暗光或绿光照射48 h后仍保持稳定。结果表明，Re-TTPY在550 nm光照射下是稳定的。
9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)首次用于评价光照射下Re-TTPY生成1O2的能力。ABDA与1O2反应，降低吸光度;从而达到检测1O2的目的。在常氧条件下(20% O2)， Re-TTPY存在时，ABDA的吸收峰随着辐照时间的增加逐渐减小。以Ru(bpy) 32 +为参照，在550 nm光照射下，其1O2量子产率(ΦΔ[1O2])为0.5。Re-TTPY的ΦΔ(10o2)可计算为0.86(表1)，Re-Cl和TTPY的ΦΔ(1O2)分别为0.25和0.3。结果表明，Re-Cl和TTPY生成1O2的能力不如Re-TTPY(Supporting Information)。据报道，AIEgen更有利于生成1O2。因此，采用ABDA法测试Re-TTPY在水(90%)和THF条件下生产1O2的能力。(Supporting Information)加水(90%)的Re-TTPY生成1O2的能力比THF强。
此外，我们使用非荧光的DHR 123探针检测了超氧化物(O2−)的产生，该探针可以与O2−反应并发出525 nm左右的强绿色荧光。当用550 nm绿光(15.5 mW cm−2)照射时，存在ReTTPY的溶液的发光量增加，表明在常氧条件下产生了O2−。TTPY在光照条件下也产生O2−，而Re-Cl在相同条件下不产生O2−(支持信息)。2,2″-Azino-bis(3乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)作为检测·OH的指示剂，·OH可被氧化，吸附增强。结果显示，在常氧条件下，Re-TTPY生成·OH。而TTPY和Re-Cl不能产生·OH。综上所述，在20%氧气条件下，Re-TTPY可以生成含1O2、O2−和·OH的ROSs。此外，经典光敏剂Ru(bpy) 32 +被用作参考光敏剂。结果表明，Ru(bpy) 32 +产生ROSs的能力远不如Re-TTPY。
在低氧(2% O2)条件下，Re-TTPY生成1O2、O2−和·OH。在缺氧条件下，1O2的生成明显减少;同时，仍产生O2−和·OH。基于这些结果，Re-TTPY生成O2−和·OH可归因于i型PDT机制，该机制涉及激发的Re-TTPY与邻近底物之间的电子转移过程。Re-TTPY具有电子D-A结构，在光照射下会产生有效的电荷分离，产生自由电子和空穴是合理的。光激发的电子和空穴将分别与电子受体O2和给体H2O反应，生成O2−和·OH。与生成1O2相比，生成O2−所需的氧气量较少。因此，它可以用于治疗缺氧肿瘤。
为了进一步证实ROSs的产生，我们用(2,2,6,6-四甲基哌啶)氧(TEMP)和5,5-二甲基吡咯啉- n -氧化物(DMPO)作为自旋阱剂进行了电子自旋共振(ESR)测量。光照后观察到明显的1O2诱导三重态信号;而在没有照射的情况下，没有观察到任何信号。此外，DMPO和Re-TTPY在光照射下的ESR谱中表现出明显的6线电子自旋共振信号，该信号来源于DMPO和O2−加合物。此外，还观察到一个典型的四线共振，其强度比为1:2:2:1，这是DMPO/•OH加合物的特征共振(Supporting Information)。这些ESR结果表明，Re-TTPY在光照射下可以生成1O2、O2−和·OH。
利用DFT和TD-DFT计算对实验结果进行了验证。Re-TTPY对TTPY产生ROSs的优越能力可归因于更有效的系统间交叉(ISC)过程，Re-TTPY的单重态-三重态能隙(0.66 eV)比TTPY (0.72 eV)小得多证实了这一点。在第四个三重态(T4)上观察到另外一个三重态分子内配体-配体相互作用(3IL)，进一步支持了这一点。表明通过分子内三重态-三重态能量转移(TTET)提高了三重态量子产率，延长了T1发射寿命。此外，Re-TTPY的T1与S0之间的能隙(1.23 eV)大于3O2 / 1O2之间的能隙(0.98 eV)。这些结果表明，Re-TTPY可以作为一种有效的PDT光敏剂。总的来说，计算结果与实验结果一致，Re-TTPY比TTPY产生更多的ROSs。
用共聚焦显微镜观察活细胞对Re-TTPY的摄取和定位。Re-TTPY孵育6小时后，B16细胞细胞质中出现明显的红色发光。通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进一步检查Re-TTPY的细胞摄取机制。当Re - ttpy处理的细胞在4℃下孵育时，细胞内发光明显减弱。这表明能量在Re-TTPY进入细胞的过程中起着重要的作用。此外，内吞作用被认为是一种能量依赖性摄取途径。氯喹和NH4Cl处理后的B16细胞对Re-TTPY的摄取明显减少。上述实验结果表明，Re-TTPY通过能量依赖的内吞途径进入细胞。为了进一步研究Re-TTPY在细胞中的分布，分别用线粒体染料Mito-Tracker Green (MTG)和LysoTracker Green (LTG)与Re-TTPY共染色。结果表明，Re-TTPY的发光与MTG和LTG的发光有重叠。Re-TTPY与MTG和LTG的Pearson共定位系数(PCC)分别为0.73和0.83。结果表明，Re-TTPY在线粒体和溶酶体中均富集。
为了更好地了解Re-TTPY的光动力学机制，我们对B16细胞中特异的ROSs生成进行了表征。首先，Re-TTPY处理的细胞在黑暗中可以忽略不计，但在常氧条件下550 nm照射(15.5 mW cm−2,1 h)后，1O2水平显著增加，这可以从单线态氧传感器绿色(SOSG)的荧光逐渐增强中看出。而在缺氧条件下，Re-TTPY + Light组细胞的sosg染色荧光明显减弱，说明光照下Re-TTPY生成1O2的能力由于氧浓度的降低而降低。同时，用双氢乙锭(DHE)和羟基苯基荧光素(HPF)探针分别检测Re-TTPY处理细胞中的O2−和·OH。结果表明，这些探针的荧光在黑暗中可以忽略不计，但在照射后显著增加。在缺氧和常氧条件下，DHE和HPF的荧光强度具有可比性，表明氧浓度的降低对O2−和·OH生成能力没有显著影响。同时，我们用DCFH-DA评价B16细胞的总ROS量。DCFH-DA和Re-TTPY处理后的B16细胞在常氧和缺氧条件下光照后显示出强烈的绿色荧光。这种不依赖氧的光敏剂在治疗缺氧肿瘤中将有很大的优势。
用MTT法测定了Re-TTPY对B16细胞的光毒性和暗毒性。在无光照条件下，Re-TTPY各浓度组孵育6 h后，细胞存活率均在90%以上。结果表明，Re-TTPY无暗细胞毒性。然而，在常氧和低氧条件下，光照射后细胞活力明显下降。结果表明，ReTTPY辐照后可通过产生ROS杀死肿瘤细胞。常温下Re-TTPY的IC50,light值为6.37 μm。相比之下，Re-Cl和TTPY都具有较差的光毒性。常氧条件下Re-TTPY的光细胞毒性指数(PI)大于15.70，低氧条件下PI值大于6.44。而TTPY的PI值仅为≈1。结果表明，在常氧和缺氧条件下，Re-TTPY均表现出优于TTPY的细胞毒性。在相同条件下，光敏剂5-ALA在光照射下没有表现出明显的光毒性。同时，我们发现Re-TTPY与正常细胞L929在黑暗条件下共孵育6小时后不产生毒性。采用钙黄蛋白乙酰氧基甲酯(Calcein - am)和碘化丙啶(PI)染色法区分活细胞(绿色)和死细胞(红色)。对照组和暗组显示强烈的绿色荧光(活细胞)，但没有红色荧光(死细胞)。而Re-TTPY光组的绿色荧光较弱，红色荧光较强，说明Re-TTPY在光照射下导致大量细胞死亡。
由于Re-TTPY在体外具有令人满意的ROSs生成能力，我们在体内(B16荷瘤小鼠C57BL/6)探讨了Re-TTPY的肿瘤光疗作用。将小鼠随机分为4组:Control组、Light组、Re-TTPY组和Re-TTPY + Light组。虽然我们通过电感耦合等离子质谱法(ICPMS)研究了静脉注射后ReTTPY的生物分布，结果显示Re-TTPY不仅存在于肿瘤组织中，也存在于肝脏和肾脏中。因此，我们采用肿瘤内注射进行体内实验，这是临床上广泛采用的PDT方法，可以通过光纤精确引导到肿瘤部位。瘤内注射Re-TTPY后，第0天进行照射。使用数字卡尺每2天监测一次肿瘤，持续12天，并计算其体积。与其他组相比，Re-TTPY + Light组的肿瘤生长受到抑制，说明Re-TTPY有效抑制了光照下的肿瘤生长。最后，在第12天处死小鼠，切除所有肿瘤组织，称重并拍照。Re-TTPY + light组平均肿瘤重量最轻。这些小鼠表现正常，没有任何疼痛、压力或不适的迹象，体重也没有改变。此外，注射ReTTPY后，小鼠主要器官未见明显损伤或炎症反应。此外，B16肿瘤组织的苏木精和伊红(H&E)染色显示，Re-TTPY与光照射联合使用时，肿瘤组织的凋亡率和坏死区域最高，表明肿瘤组织细胞损伤明显。经ReTTPY + Light处理后，小鼠存活率明显提高。所有结果表明，Re-TTPY + Light处理导致细胞凋亡水平明显高于其他处理。
基于Re-TTPY具有良好的体外肿瘤治疗效果，进一步探讨其光动力作用的深层机制。NADH是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸I，在维持细胞生长、分化、能量代谢和细胞保护等方面起重要作用。NADH失衡会破坏氧化还原平衡，破坏癌细胞。在这里，我们测量了Re-TTPY (20 μm)在光照下光催化氧化NADH。随着辐照时间的增加，Re-TTPY存在下的NADH (150 μm)在339 nm处的特征吸收峰明显降低。相反，Re-TTPY组和Light组的紫外-可见吸收没有降低(Supporting Information)。然后，我们计算了NADH的氧化周转率(TON)，以此来评价Re-TTPY的光催化效率。光照下Re-TTPY的TON值为5.42。较暗组(TONdark = 0.35)为高。此外，Re-TTPY在D2O/DMSO (1/2 v/v)中光催化氧化NADH的1H NMR谱进一步监测。光照射2 h后，NADH转化为NAD+， NAD+的烟酰胺环上的h原子在5.85、8.08、8.13、8.15、8.38、8.59、8.77和9.17 ppm处出现新的峰，如1H NMR谱图所示。然而，在没有ReTTPY的情况下，没有观察到NAD+峰。
对于细胞NADH水平的测量，在光照射下，与未处理组相比，rettpy处理的细胞表现出较低的NADH水平。此外，活细胞线粒体中nadh依赖的细胞氧化还原酶能够将MTT还原为紫色不溶性甲醛。在黑暗中，与未处理的细胞一样，经Re-TTPY处理的B16细胞产生了Formazan。对于接受辐照的细胞，甲醛的形成明显减少。这可归因于Re-TTPY光催化NADH耗竭。结果表明，Re-TTPY在光照射下对NADH具有良好的光催化性能。
铁死亡是一种铁依赖性程序性细胞死亡。研究表明，O2诱导的谷胱甘肽耗竭是铁死亡的标志之一。因此，以5,5′-二硫代比斯-2硝基苯甲酸(DTNB)为指标，研究Re-TTPY在溶液水平上消耗谷胱甘肽的能力。随着光照射时间的增加，412 nm处的特征吸收峰逐渐减小，溶液颜色由黄色变为淡黄色。进一步测定B16细胞GSH水平。在光照射下，Re-TTPY处理的细胞比未处理的细胞表现出较低的GSH水平，这意味着Re-TTPY可以在光照射下消耗GSH。
最近发现上睑死亡与癌症免疫治疗有关。死亡细胞表面钙网蛋白(CRT)暴露增加，死亡细胞中高迁移率组蛋白盒-1 (HMGB1)的释放是ICD的重要标志。评价Re-TTPY体外诱导ICD的能力。采用CLSM分析不同处理后CRT暴露量及HMGB1释放量。与其他组相比，由于细胞死亡，Re-TTPY + Light组的CRT漏出，导致绿色荧光明显增加。此外，我们采用免疫荧光法检测HMGB1在B16细胞中的释放情况。与其他对照组相比，Re-TTPY + Light组的绿色荧光明显分布在细胞质中。结果表明，Re-TTPY + Light组HMGB1从细胞核释放到细胞质中。同时，B16细胞上清液中HMGB1的释放量增加。这些结果表明，Re-TTPY在光照射下诱导体外ICD。
由于Re-TTPY可以在体外诱导ICD，我们随后评估了其在体内增强抗肿瘤免疫反应的能力。dc成熟的标志是dc共刺激分子CD86的表达上调。dc的成熟状态决定了T细胞活化的最终结果，因为成熟的dc可以分泌大量的刺激信号，这些信号可以与T细胞接触，刺激抗癌免疫。肿瘤组织切片浸润的细胞毒性T细胞和B细胞分别用CD8+、CRT和CD86抗体进行标记。与对照组相比，Re-TTPY + Light组CD8+、CRT和CD86的表达增加。流式细胞术实验结果显示，Re-TTPY + Light处理使脾脏中CD8+ T细胞的百分比从≈6.9%增加到12.4% (CD3+， CD8+ T淋巴细胞，支持信息)。此外，被认为是dc成熟标志的CD86 CD80细胞也从≈3.5%增加到23.7%。以上结果表明，Re-TTPY +光照射可增加肿瘤中dc的募集和成熟dc的浸润。ELISA法检测细胞因子(白细胞介素10 [IL-10]、IFN- <s:1>、TNF- <s:1>)的分泌。与Control组、Light单独组和Re-TTPY单独组相比，ReTTPY + Light组TNF- rp和IFN- <s:2>显著上调，IL10下调。综上所述，死细胞释放CRT和HMGB1促进了dc的成熟。成熟的树突状细胞分泌大量刺激信号，与T细胞接触，促进肿瘤坏死TNF- rfs等免疫相关细胞因子的上调和IL-10的下调，从而达到免疫治疗的目的。同时，dc的成熟增加了CD8+ T细胞。免疫相关细胞因子(如IFN- <s:1>)被CD8+ T细胞释放并上调。结果表明，rettpy介导的PDT可有效提高体内抗肿瘤免疫应答水平。
总结
我们报道了一种具有电子D-A结构的新型铼络合光敏剂(Re-TTPY)。该光敏剂通过能量转移过程产生1O2，通过电子转移过程产生·OH和O2−。这是一种设计抗缺氧肿瘤的新型结构方案。体外和体内实验表明，Re-TTPY产生的细胞ROSs可消耗GSH，导致GPX4下调，最终导致铁死亡。铁死亡激活ICD，促进dc成熟，促进TNF- r和IFN- r的释放;同时下调IL-10。IFN- <s:1>可进一步下调GPX4，增强肿瘤细胞的铁死亡。因此，Re-TTPY作为一种有前景的光敏剂，实现了铁死亡和免疫治疗结合的″闭环″治疗。
参考文献
An Electron Donor–Acceptor Structured Rhenium(I) Complex Photo-Sensitizer Evokes Mutually Reinforcing "Closed-Loop" Ferroptosis and Immunotherapy ,Qingyan Ren, Haobing Wang, Dan Li, Anyi Dao, Jiajun Luo, Deliang Wang,* Pingyu Zhang,* and Huaiyi Huang*, Adv. Healthcare Mater. 2024, 2304067, https://doi.org/10.1002/adhm.202304067
