内容提要
现有氨基糖苷类抗生素(AGs)的有效性不断下降，迫使我们寻求新的方法来提高现有AGs的敏感性。我们提出了一种新的策略，包括合理构建聚集诱导发射发光材料(AIEgen)，以显著提高革兰氏阳性菌对AGs的敏感性。这种方法的应用包括简单地将AIEgens添加到细菌中，然后进行5分钟的光照射。在光照下，细菌有效地产生活性氧，将细菌内活性氧水平提高到非致死阈值。治疗后，细菌迅速进入超敏状态，导致对三种AGs(卡那霉素、庆大霉素和新霉素)的敏感性分别增加21.9倍、15.5倍和7.2倍。这种方法对AGs是特异性的，并且诱导的超敏反应表现出无与伦比的持久性和遗传性。进一步的体内研究证实，通过这种新方法，AGs对革兰氏阳性细菌的杀菌能力提高了7.0倍。这项研究不仅拓宽了AIEgens的潜在应用，而且为增强AGs对抗细菌感染的有效性提供了新的途径。
结果与讨论
AIEgens的合成与表征
采用Knoevenagel缩合和烷基化方法，合成了4种带正电的化合物TCSVP、TCSVP- c2、TCSVP- c3和TCSVP- c4，它们具有不同的烷基链。这四种化合物具有典型的D-π-A结构(三苯胺为强电子供体，吡啶盐为有效电子受体)、扭曲的几何结构以及HOMO(最高占据分子轨道)LUMO(最低未占据分子轨道)的相对分离，这使它们具有强大的ROS生成能力，可以激发细菌对AGs的超敏感状态。通过简单地调整与吡啶氮共价偶联的烷基链的长度，可以调节四种化合物的亲脂性，并通过计算的正辛醇/水分配系数(Clog P)值来确定它们的疏水性。由图1A可知，随着烷基链的延长，ClogP值从3.401增加到4.988，说明烷基链工程在分子疏水性调节中的重要作用。四种化合物的吸收光谱非常相似，光谱最大值在460 nm左右。四种分子的荧光光谱具有明显的远红发射(峰值>650 nm)，光谱形状相似，但强度不同。TCSVP- c4的荧光强度最强，而TCSVP的荧光强度最弱。有趣的是，在这四种化合物中，TCSVP- c4的ClogP值最高，TCSVP的ClogP值最低。这种现象可以理解为ClogP值越大意味着越疏水，导致水溶液中的聚集程度越高，从而导致分子中苯环旋转等受限分子运动更紧密，从而节省了更多的非辐射衰变能量。然后，通过测量四种分子在不同体积比的二甲基亚砜(DMSO)/水(DMSO为好溶剂，水为差溶剂)混合物中的荧光强度，评价了四种分子的AIE性质。随着能形成聚集体的不良溶剂比例的增加，四种分子的荧光强度逐渐增强，AIE效应明显。因此，这四种分子可以被鉴定为AIEgens。TCSVP-C4表现出最强的AIE性质和荧光强度，表明分子内运动受限程度最高，这与ClogP值的结果可以很好地印证。
然后用ROS指示剂2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)测定4种AIEgens的ROS生成能力，DCFH-DA可与ROS反应生成具有强绿色发光的二氯荧光素(DCF)。在相同的条件下，所有这些AIEgens都表现出几乎相同且高效的ROS生成，这表明得到了一系列具有不同长度烷基链修饰的aie活性光敏剂。我们以9,10蒽二基双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)为单线态氧指标，评价了四种AIEgens的单线态氧生产效率，将ABDA加入到含有AIEgens的PBS溶液中，并将其置于光照下，ABDA的吸收率迅速下降。相反，在无氧PBS溶液中进行同样的实验，ABDA的分解率下降到不除氧PBS的10%以下。这表明AIEgens可以在光照下快速生成单线态氧，从而导致ABDA的高效分解。革兰氏阳性细菌、金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)在“免洗”模式下可在1分钟内快速染色，而革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)即使孵育时间延长至2小时也无法染色。这一结果清楚地表明，这四种AIEgens能够特异性、快速地结合和识别革兰氏阳性菌。这一现象与已报道的许多带正电的AIE分子一致。然后测定AIEgens在含金黄色葡萄球菌和不含金黄色葡萄球菌(~107 CFU/mL)的PBS溶液中的荧光强度，并显示加入金黄色葡萄球菌前后的荧光强度比值值。结果显示，与纯PBS中相比，4种溶液与金黄色葡萄球菌混合后的荧光强度从1.2倍提高到4.0倍(处于相对松散的聚集状态)，说明AIEgens与金黄色葡萄球菌结合时的分子运动比在纯PBS中形成聚集时受到更严格的限制。然后用DCFH-DA评价这些AIEgens与金黄色葡萄球菌混合后产生的ROS。四种AIEgens在光照射下表现出相似且有效的ROS生成能力，确保了细菌内部ROS的高效可控诱导。随后，检测了4种AIEgens对金黄色葡萄球菌和人胚胎肾细胞系HEK293T、人肝细胞系L-02的光毒性。四种分子对细菌的抑制作用无显著差异，但细胞毒性差异明显。其中，TCSVP在细胞光毒性试验中表现出最好的安全性。此外，从TCSVP- c4到TCSVP, 4种AIEgens的细胞安全性表现出明显的逐渐提高的趋势，这表明即使烷基链的微小差异也会导致细胞选择性和细胞毒性的巨大差异。此外，ClogP越低，细胞安全性越好，这与文献报道也很吻合。为了进一步探讨TCSVP对金黄色葡萄球菌和哺乳动物细胞的靶向能力，在金黄色葡萄球菌和L-02细胞共存的情况下，收集TCSVP的CLSM图像。从结果来看， TCSVP主要集中在细菌上，说明当细菌和哺乳动物细胞共存时，TCSVP对金黄色葡萄球菌具有选择性。因此，选择TCSVP作为药物进行以下药敏实验。
提高细菌对AGs的体外敏感性
首先，使用HEK293T细胞在黑暗中评估TCSVP的细胞毒性。当TCSVP的孵育浓度达到25 μM时，HEK293T细胞的24小时存活率仍然大于80%。随后，对TCSVP在光照和不光照条件下对金黄色葡萄球菌的杀菌效果进行了评估。如图S23所示，8 μM TCSVP在黑暗中孵育2小时后，有轻微的杀菌效果。与此相反，当金黄色葡萄球菌与1 μM的TCSVP在37℃下孵育1 min，并暴露于50 mW/cm2的光照射下时，由于过量的ROS逐渐积累，随着暴露时间的延长，可以观察到明显的杀伤效果。正如我们所知，理想的抗生素佐剂通常是非杀菌的。因此，我们选择了1 μM TCSVP, 5 min辐照的中等条件，在此条件下产生的ROS不能直接杀死金黄色葡萄球菌，以进一步评价其在杀死金黄色葡萄球菌过程中的敏感性增强效果。“TCSVP + L + GEN”组，先用1 μM的TCSVP在37℃下孵育金黄色葡萄球菌1 min，然后在50 mW/cm2的光照下孵育5 min，并立即加入庆大霉素(GEN, 1 μg/mL)。然后将处理后的金黄色葡萄球菌在37℃黑暗条件下孵育2 h，最后用传统的平板计数法测定杀菌效果。[46]将未给药的细菌、TCSVP、Light和庆大霉素分别作为“对照”、“TCSVP”、“L”和“GEN”。根据结果,不能直接被治疗金黄色葡萄球菌TCSVP +光(“TCSVP + L”),但这种治疗可以强有力地促进金黄色葡萄球菌的敏感性,创了15倍,表明活性氧产生“TCSVP + L”治疗高效激动人心的金黄色葡萄球菌从正常状态高度敏感状态,此外,将军,因为没有ROS生成“L +创”和“TCSVP +创”组,没有观察到增强效应,再次证明活性氧的产生是必要条件。
为了进一步研究金黄色葡萄球菌对抗生素的这种过敏状态是否普遍存在，我们选择经典类型的抗生素，包括β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、喹诺酮类和氨基糖苷类进行同样的实验。对另外两种氨基糖苷，卡那霉素(kanamycin)和新霉素(neomycin)的抗菌敏感性分别显著提高了21.9倍和7.3倍以上。将“TCSVP + L + KAN”和“TCSVP + L + NEO”与对应的“L + KAN”和“L + NEO”组合进行比较，可以观察到这一点。有趣的是，在同样的TCSVP和光处理后，随后暴露于任何其他类型的抗生素，包括氨苄西林(β-内酰胺类)、四环素(四环素类)、红霉素(大环内酯类)和诺氟沙星(喹诺酮类)，均未观察到明显的敏感性增强作用。这些结果表明，TCSVP引发的金黄色葡萄球菌过敏状态对氨基糖苷类抗生素具有特异性。然后，利用另一种革兰氏阳性菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来评估处理菌的过敏状态是否依赖于特定菌株。枯草芽孢杆菌对GEN的敏感性提高了7.2倍以上，说明tcsvp处理菌的过敏状态并不局限于特定的革兰氏阳性菌株。此外，我们选择了一种众所周知的多药耐药菌株——耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，进一步评估了这种新方法对GEN的敏感性增强。MRSA对GEN的敏感性提高了~5.0倍，提示该方法可有效提高耐药菌株对AGs的敏感性。接下来，我们使用HEK293T和小鼠巨噬细胞RAW264.7两种细胞系进行上述实验，研究TCSVP处理是否可以增强GEN在哺乳动物细胞中的细胞毒性。简单地说，将HEK293T细胞在增加TCSVP浓度的条件下孵育5分钟，然后在50 mW/cm2的光照下孵育5分钟，然后在处理后的细胞中分别添加或不添加GEN (10 μg/mL，剂量是细菌的10倍)孵育24 h。最后通过MTT试验测定细胞活力。从图3E的结果来看，“TCSVP + L”组与“TCSVP + L + GEN”组之间没有明显差异，说明该方法对细胞毒性没有增强作用。这意味着基于tcsvp的治疗特异性地增强了细菌对GEN的敏感性。此外，尽管TCSVP和GEN的浓度比细菌实验高10倍，但24 h的细胞存活率仍在80%以上。
金黄色葡萄球菌对AGs超敏的特征
为了进一步研究这种超敏状态的特点，我们先用TCSVP和光照触发金黄色葡萄球菌，然后将处理后的金黄色葡萄球菌分别在1×PBS(磷酸盐缓冲盐水)或LB (Luria-Bertani)溶液中37℃培养1 h，再暴露于GEN (1.5 μg/mL)中2 h，最后通过平板计数法测定其杀菌效果。处理流程如图4A、4D所示。如图4A-C所示，在1×PBS中孵育1 h后(未经额外处理)，经TCSVP和光预处理的金黄色葡萄球菌对GEN的敏感性比仅经光预处理的金黄色葡萄球菌提高了7.3倍，说明TCSVP介导的ROS产生引起的金黄色葡萄球菌对GEN的超敏状态可以维持较长时间。然后用适合细菌快速增殖的LB溶液代替PBS。在LB溶液中，金黄色葡萄球菌的数量在37℃下1 h内扩增约8倍。令人惊讶的是，经TCSVP和光照处理后1小时大量增殖后，扩增的金黄色葡萄球菌对GEN的敏感性仍然增强了5.5倍，表明这种超敏状态在一定程度上显示出一种遗传特征，这在以前很少有报道。
增强金黄色葡萄球菌对AGs的体内敏感性
首先通过肝、肾功能测定和主要脏器H&E染色分析，评价TCSVP在体内的生物安全性。将健康雌性小鼠随机分为两组，每组n = 3，分别命名为“Control”和“TCSVP”。“TCSVP”组小鼠静脉注射TCSVP (100 μM, 100 μL)，溶解于生理盐水和DMSO (DMSO:体积的1%)的混合物中。未作任何处理的小鼠为“对照组”。7 d后处死小鼠，采集血清及主要代谢器官(心、肝、脾、肺、肾)。TCSVP治疗后未见明显病理改变和肝肾功能损伤，具有良好的体内生物相容性。
接下来，在皮肤感染小鼠模型中评估细菌对AGs的敏感性增强。与体外实验相同，共设8组，每组n = 4，编号为1 ~ 8。在同一只小鼠背部的4个位点依次设置1 ~ 4组，“轻”组皮下注射活金黄色葡萄球菌，位点3和4为“TCSVP”组和“TCSVP + L”组皮下注射活金黄色葡萄球菌与TCSVP (1 μM)的混合物。30 min后，用白光(50 mW/cm2)照射2、4个位点15 min, 6 h后收集4个位点的皮肤组织，用平板计数法测定细菌数量。“GEN”(5)、“TCSVP + GEN”(6)、“L + GEN”(7)和“TCSVP + L + GEN”(8)组对应的5 ~ 8号位点的处理程序与位点1 ~ 4的处理程序相似。唯一的区别是在光照后立即进行GEN腹腔注射(2.4 mg/kg)。“Control”组、“Light”组和“TCSVP”组的细菌存活数量具有可比性，说明仅光或TCSVP处理不会对细菌造成任何伤害。与“Control”组相比，“TCSVP + L”组的活菌数量也没有明显减少，说明TCSVP产生的ROS是适度的，不足以直接杀死位点4的细菌。另一方面，一旦给小鼠注射GEN, 6 h后“GEN”组的存活细菌数量明显比“Control”组减少了6倍。令人鼓舞的是，与“GEN”、“L + GEN”和“TCSVP + GEN”组相比，“TCSVP + L + GEN”组的细菌数量进一步减少了7.0倍，与“Control”组相比减少了46.8倍。此外，在“TCSVP + GEN”组和“L + GEN”组中，由于不产生ROS，对感染部位进行TCSVP预处理或单独光处理均未显著增强GEN对细菌的杀伤作用，这说明体内增强GEN作用需要产生ROS。这些结果表明，TCSVP在光照射下产生的ROS能够作为一种有效的佐剂，增强细菌对GEN的敏感性，这与体外实验结果吻合良好，验证了TCSVP对S的激发能力。金黄色葡萄球菌在体内对GEN过敏。此外，该结果也证明了该方法在体内具有良好的抗菌效果，为对抗革兰氏阳性细菌感染提供了新的见解。
总结
综上所述，我们提出了一种使用AIEgen来增强AGs对革兰氏阳性细菌感染的杀菌活性的新方法。在这项研究中，我们首次强调，在细菌中诱导非致死性氧化应激代表了一种有希望的策略，可以诱导细菌的过敏状态进行抗生素治疗。与银等试剂相比，AIEgens能够产生活性氧(ROS)，并以光可控的精度实时提高细菌内ROS水平。LUMO-HOMO独特的扭曲几何结构和有效的分离，加上强大的供体和受体部分，赋予这些AIEgens优越的ROS生成能力。通过烷基链工程对AIEgen疏水性的调控进一步显著提高了生物安全性。此外，利用AIE机制的优势，这些AIEgens还可以“免洗”快速区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，灵敏度高。本研究开创性地建立了AIE与抗生素致敏之间的联系，显著拓宽了AIEgens作为抗生素治疗强效佐剂的应用范围。
参考文献
Exciting Bacteria to a Hypersensitive State for Enhanced Aminoglycoside Therapy by a Rationally Constructed AIE Luminogen ，Chao Chen, Xing Li, Yilin Wang, Yingshu Sun, Yixuan Bao, Jianyu Zhang, Ruoyao Zhang*, Ryan T. K.Kwok, Jacky W. Y. Lam, Duo Mao*, Peng Hou and Ben Zhong Tang*，Adv. Healthcare Mater.， https://doi.org/10.1002/adhm.202400362
