内容提要
作为一种程序性细胞死亡的炎症形式，焦亡作为一种很有前景的癌症免疫治疗途径引起了越来越多的关注。然而，很少有近红外(NIR)光激活热亡诱导剂的分子设计策略被开发出来。本文首次提出了一种溶酶体靶向的NIR I型光诱导超氧自由基(O2−•)发生器(ENBS)，它可以引起焦亡和抗肿瘤免疫。在这项工作中，ENBS不仅选择性地在溶酶体中积累并破坏溶酶体的完整性，而且还诱导气皮蛋白D (GSDMD)介导的焦亡。因此，它最终促进树突状细胞(DCs)的成熟，在体内实现T细胞介导的免疫激活。据我们所知，这是通过caspase-1/GSDMD途径建立的基于近红外光激活超氧化物自由基焦亡生成物的免疫治疗系统的第一个例子，有望为焦亡介导的癌症免疫治疗提供有价值的指导。
结果与讨论
ENBS染料的溶液性质研究
ENBS在治疗波长区域具有较强的近红外吸收，对正常细胞具有较深的组织通透性和较低的光毒性。此外，在最佳激发波长为~ 660 nm时，可以收集到相当强的近红外荧光。此外，以Rhodamined800为对照，计算出ENBS的荧光量子产率为3.14%，完全可以满足体内无创实时成像的要求。此外，ENBS在不同pH值和温度下表现出优异的稳定性，这有利于细胞和体内研究。最后，利用商用探针ICG测试了ENBS在660 nm辐照下的光稳定性。即使在长达2小时的恒定激光照射下，ENBS仍能保持80%的初始荧光信号，显示出优异的抗光漂白性能。相比之下，ICG在经历了精确的激光照射时间后，其荧光强度下降到初始荧光强度的30% ~ 40%左右。
作为这项工作中最关键的参数之一，ENBS产生O2−•的能力首先在溶液阶段和细胞水平上进行了检测。为了澄清，采用DHR123作为O2−•指示探针，一旦与O2−•反应，在525 nm处产生强烈的荧光信号。在辐照10分钟内，DHR123的荧光明显增强，这表明ENBS可以作为一种有效的可活化O2−•引发剂。相反，II型PDT单线态氧探针9,10-蒽二丙酸(ABDA) 55在相同的实验条件下没有发生明显的荧光变化，进一步证实了该体系中产生的活性氧主要是O2−•，而不是单线态氧。此外，在660 nm照射后观察到温度升高。由此可以得出，在光化学反应过程中，ENBS可以通过I型电子转移途径将其激发能传递给三态氧生成O2−•。
细胞中超氧自由基的研究
在体外超氧自由基生成评估之前，我们研究了4T1细胞摄取ENBS的最佳时间和浓度。在1 h的孵育时间内，ENBS (1 μM)的荧光强度达到峰值，并维持了一段时间。采用甲基噻唑四氮唑(MTT)法测定ENBS的抗肿瘤潜能。分别用不同浓度(0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12、10.24 μM)的ENBS在不同照射条件和不同氧含量环境下处理4T1乳腺癌细胞。即使在10.24 μM的光照射下，4T1细胞在无光照射条件下的存活率仍大于87%，表明其具有良好的生物相容性。辐照后，细胞活力随着浓度的增加而显著降低，证实了细胞毒性O2−•的产生是剂量依赖性的。受ENBS生成O2−•的优异性能启发，在缺氧环境下进一步研究了光诱导处理效果。在不光照的情况下，氧浓度对ENBS的细胞毒性没有明显影响。辐照后，即使在低氧条件下(2% O2)， ENBS也能以剂量依赖性途径杀死癌细胞，这在低氧肿瘤微环境下是有利的。计算得到辐照后ENBS的IC50值为7.26 μM。由于ENBS在水中具有强大的O2−•生产能力，在活细胞中具有优越的光稳定性，通过双氢乙啶(DHE, O2−•测定试剂盒)染色测量，研究了在常氧和缺氧条件下光触发的细胞内O2−•生成56在常压条件下，经过660 nm光照射后，由于O2−•的产生，荧光显微镜观察到细胞内出现了鲜红色的荧光，并且随着照射时间的增加，荧光强度逐渐增强。同时，以维生素C (Vc)作为自由基清除剂进行对照试验。一旦用Vc预处理样品，对照组细胞内相对O2−•生成急剧下降。为了模拟低氧肿瘤微环境，我们探索了低氧条件下(2% O2) O2−•的生成。与正常氧条件相比，在缺氧条件下培养的细胞中，DHE探针显示出相似的荧光强度，这表明ENBS仍然表现出令人满意的O2−•生成兼容性，可以为缺氧肿瘤治疗创造必要的兵工厂。综上所述，ENBS可以克服肿瘤缺氧限制，因为在酸性条件下产生的O2−•可以作为ROS发生器通过Haber-Weiss或Fenton反应形成•OH。
随后，进行钙黄素AM(绿色，活细胞)和碘化丙啶(红色，死细胞)染色，进一步研究细胞杀伤作用。在没有照射的情况下，用ENBS孵育的4T1细胞仍然保持较高的细胞活力，这与仅光照射细胞的对照组相似。在常氧和缺氧条件下，处理组均观察到显著的凋亡信号，表明产生的O2−•会导致癌细胞凋亡。
溶酶体靶向的杀伤机理研究
为了阐明ENBS在治疗中的作用，通过共定位分析研究了其在细胞内的具体分布。用ENBS和细胞器指示探针(包括DAPI、线粒体和溶酶体追踪器)孵育4T1细胞。使用LysoTracker Green荧光染料检测到较高的Pearson’s系数为0.95，说明ENBS主要位于溶酶体中。相反，ENBS与细胞核或线粒体跟踪器的相关系数较低。在指出ENBS对溶酶体的定位后，我们跟踪了ENBS对溶酶体的定位时间。通过用ENBS计算LysoTracker Green荧光染料的Pearson系数值，我们推测ENBS可以在60min内完成溶酶体的定位。
溶酶体作为一种重要的动态细胞器，可以通过分泌和吞噬膜转移途径降解许多生物大分子。特别是溶酶体的完整性决定了它们的详细功能。因此，破坏溶酶体的完整性将导致溶酶体膜渗透，通过不同的细胞过程启动程序性细胞死亡为了澄清，用吖啶橙(AO)染色研究溶酶体的完整性，用荧光底物Magic Red MR-(RR)2监测组织蛋白酶B的释放过程。AO kit是一种公认的用于探索溶酶体完整性的异色荧光探针，在完整的溶酶体中呈质子化低聚体状态，发出红色荧光。然而，当探针在细胞核和细胞质中时，其去质子化形式显示绿色荧光。作为对照，在PBS、ENBS和光处理细胞中发现AO的显著红色荧光，表明溶酶体是完整的。相反，在660 nm照射下，溶酶体的完整性被破坏，在常氧和缺氧条件下AO的红色发射消失。此外，核形态萎缩，变小，细胞明显塌陷在明亮的视野照片。据报道，在酸性溶酶体条件下，组织蛋白酶B可以被激活来消化凋亡调节蛋白，并诱导随后的生理反应，包括抗原呈递、细胞凋亡和焦亡细胞死亡。辐照后，在4T1细胞中观察到Magic red MR-(RR)2的红色荧光减弱，表明enbs介导的PDT过程诱导溶酶体向细胞质释放组织蛋白酶B。
白色箭头所示，膜周围有直径约5 μm的泡状突起。在细胞焦亡过程中发现了特异性的泡状突起，定义为焦亡体。受膜周围典型形态变化的启发，我们进一步探索了质膜染色研究，以证明焦亡的激活。采用具有绿色荧光的CellMask DIO作为一种可用的生物探针进行质膜染色。经ENBS处理后，4T1细胞周围可见许多泡状突起(DIO绿色荧光显示)。相比之下，未经辐照的ENBS培养组和PBS组的4T1细胞未见形态学变化。同时，扫描电镜(SEM)显示，与对照组不同，焦亡细胞呈煎蛋状，胞质明显压扁。这些形态学变化表明ENBS可以通过光活化O2−•生成诱导热噬细胞死亡。
Western blot (WB)法、免疫荧光法、酶联免疫吸附法(ELISA)检测4T1细胞GSDMD、caspase-1蛋白表达及促炎细胞因子释放，观察细胞形态学变化。与PBS对照组相比，ENBS暗处理的4T1细胞GSDMD和caspase-1水平无显著变化。在辐照下，通过WB检测，enbs处理组裂解的GSDMD和裂解的caspase-1的表达水平升高，表明caspase-1和GSDMD的裂解是通过enbs启动的焦亡激活实现的。此外，与对照组相比，ENBS处理的4T1细胞在常氧和缺氧条件下的caspase-1表达水平升高。这些数据支持了ENBS可以作为智能O2−•发生器，并通过激活caspase-1/GSDMD介导的途径诱导高效细胞焦亡的命题。在焦亡的激活过程中，细胞内内容物的释放，包括肿瘤相关抗原如LDH和炎症细胞因子(IL-18和IL-1β)，是诱导抗肿瘤免疫反应的关键。为了说明，作为焦亡的明显证据，检测到细胞内LDH释放到细胞外基质。正如预期的那样，在ENBS组中观察到LDH的浓度依赖性增加，而在对照组中检测到LDH的释放可以忽略不计。裂解的GSDMD蛋白促进细胞膜上GSDMD孔的形成，导致IL-18和IL-1β等促炎细胞因子的释放。为此，用ELISA法测定不同浓度ENBS处理4T1细胞后，4T1细胞培养基中IL-18和IL-1β的浓度。
同样，ENBS处理后细胞因子IL-18和IL-1β的含量也增加。这些ELISA结果表明，ENBS可以激活caspase-1，进一步促进GSDMD气孔的形成，并伴随促炎细胞因子的释放。由于上述良好的细胞焦亡表现，随后通过测量损伤相关分子模式(DAMPs)来探索免疫原性的改善。DAMPs的释放可以增强肿瘤细胞的免疫原性，促进树突状细胞(dc)的抗原呈递能力，并诱导严重的内部T细胞介导的免疫反应。这些明显的标志是三个必要的免疫原性信号，包括高迁移率组盒1 (HMGB1)从细胞核迁移到细胞外环境，细胞表面暴露钙网蛋白(etcoCRT)，以及细胞外ATP的分泌。因此，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测量分泌到上清液中的ATP的量。辐照下的ENBS处理会促进ATP的分泌。免疫荧光测量显示，与对照组相比，ENBS + 660 nm辐照处理组etco-CRT的绿色发射增强，表明ENBS刺激后etco-CRT有效释放。同时，作为ICD的另一个重要生物标志物，HMGB1在ENBS加辐照组的外排明显减少，HMGB1在辐照后最终从肿瘤细胞中释放出来。上述DAMPs结果表明，经ENBS +辐照诱导的热噬细胞具有较高的免疫原性，具有诱导抗肿瘤免疫应答的潜力。
树突状细胞(dendritic cells, dc)是一种重要的抗原呈递细胞(antigen-presenting cells, APCs)，可以诱导机体T细胞激活先天免疫和适应性免疫在ICD的发展过程中，来自死亡肿瘤细胞的肿瘤相关抗原可以诱导dc成熟并进一步引起抗肿瘤免疫反应。因此，作为树突状细胞成熟的标志，我们在体外评估了树突状细胞(CD80+ CD86+)的成熟度，这是启动适应性免疫的必要条件具体来说，未成熟骨髓来源的dc (bmdc)与enbspred4t1细胞共培养过夜。流式细胞术检测显示，实验组经ENBS +辐照预处理的成熟CD80+ CD86+ dc的比例较PBS处理的对照组(73.4%)显著增加至86.2%，表明ENBS介导的光疗增加了成熟dc的表达。此外，还通过ELISA检测血清肿瘤相关抗原水平来评估DCs的抗原提呈能力。DCs与ENBS预处理的4T1细胞共孵育后，肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素6 (IL-6)和白细胞介素12 (IL-12p70)显著升高，提示死亡肿瘤细胞产生的增强的肿瘤相关抗原可诱导DCs成熟。在评估小鼠的抗肿瘤作用之前，我们首先通过三维多细胞肿瘤球体模拟建立实体瘤来评估ENBS在缺氧环境下诱导PDT的能力。首先，5 μM ENBS与直径大于700 μM的4T1肿瘤球体孵育30 min后，整个球体出现较强的荧光强度，表明ENBS已成功浸润实体模拟肿瘤。在660 nm (25 mW cm−2,30 min)照射下，肿瘤细胞球逐渐塌陷，并在第3天几乎全部破裂，表明ENBS对缺氧实体瘤的潜在PDT作用。相比之下，未经辐照的ENBS单独处理细胞球的形态学变化可以忽略不计，说明ENBS具有良好的生物相容性。
首先，我们进行了ENBS的体外生物相容性测试。溶血活性测定显示ENBS的溶血率很低;即使在最高浓度(8 μg/mL)下，也仅为4.43%。在进行体内抗肿瘤实验之前，我们首先在4T1乳腺肿瘤模型中证实了ENBS的有效肿瘤蓄积。体内荧光成像显示，注射后1小时ENBS开始向肿瘤部位增殖。注射后150分钟达到平稳水平。此外，我们在注射ENBS 150 min后对小鼠的主要器官进行了荧光成像。在体内随访实验中，ENBS在肿瘤部位的最大蓄积量，为引起热凋亡和免疫反应提供了适当的条件。enbs诱导的体外焦亡具有较高的免疫原性，促进了体内抗肿瘤免疫应答的进一步研究。当肿瘤体积达到~ 100 mm3时，将4T1荷瘤BALB/c小鼠随机分为三组(n = 5):(a) PBS组，(b) ENBS组，(c) ENBS加光照射组。经660 nm辐照后，ENBS可抑制肿瘤生长，但不影响试验组小鼠的体重。同时，ENBS加辐照组小鼠的生存时间比其他组更长。此外，ENBS加辐照组未见异常行为。并用苏木精和伊红(H&E)染色进行主要脏器的组织化学分析。在心脏、肝脏、肺和肾脏未观察到明显的结构和病理改变，表明ENBS具有良好的生物安全性。最后，在实验结束后，采集各组小鼠血液，比较ENBS +辐照组与对照组血液标志物的表达情况。数据的不显著差异进一步证明了ENBS指导治疗的良好生物安全性。此外，用H&E-和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dutp -生物素末端标记(TUNEL)染色的肿瘤切片进一步证实了其良好的抗肿瘤作用。
第27天处死小鼠，提取脾脏单细胞悬液进行流式细胞术分析，以评估dc和T细胞的表达。我们首先用流式细胞术分析了脾脏中树突状细胞(CD11c+ CD80+ CD86+)的活化。与体外实验结果一致，与所有其他处理相比，ENBS +辐照组(20.3%)对DCs成熟的诱导作用最高，分别比ENBS组(8.24%)和PBS组(7.26%)高2.46倍和2.80倍。众所周知，CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CD8+ T细胞)可以通过释放细胞毒素杀死癌细胞，细胞毒素在抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。
因此，用流式细胞术分析不同处理后脾脏中的辅助性T细胞(CD4+)和细胞毒性T细胞(CD8+)。enbs介导的治疗组显著提高了CD4+和CD8+ T细胞的比例。此外，通过免疫荧光染色法分析肿瘤切片中的CD4+和CD8+ T细胞。与对照组相比，ENBS +照射治疗组肿瘤组织中CD4+和CD8+ T细胞的表达也显著，表明免疫激活良好。采用ELISA法测定血清肿瘤相关抗原(TAA)浓度，检测成熟树突状细胞的抗原提呈能力。在ENBS加辐照小鼠中发现IFN-γ、IL-6、IL-1β和IL-12p70等细胞因子含量最高，表明ENBS介导的治疗可以引起强烈的抗肿瘤免疫反应。为了进一步探讨其具体的抗肿瘤机制，对肿瘤切片进行caspase-1抗体(fitc偶联二抗)染色。在ENBS加辐照处理的肿瘤切片中，观察到caspase-1通道的明显绿色荧。与体外实验结果一致，t细胞介导的免疫反应导致HMGB1从细胞核迁移到细胞外环境(荧光信号减弱)和细胞表面暴露于CRT(荧光信号增强)，而对照组的荧光变化可以忽略不计。这些免疫荧光染色结果进一步验证了ENBS可以通过炎性caspase-1依赖性途径引起焦亡，从而引发抗肿瘤免疫应答。由此可见，ENBS有可能作为近红外光激活引发剂用于焦热介导的肿瘤免疫治疗。
总结
我们首次合成了I型NIR光激活超氧化物自由基生成物ENBS，并将其用于有效诱导癌细胞焦亡，激活抗肿瘤免疫应答。具体来说，ENBS可以选择性地在溶酶体中积累，引起溶酶体肿胀，并导致组织蛋白酶b的释放。此外，ENBS作为近红外超氧化物自由基的产生者，通过caspase-1/ gsdmd依赖性途径引起肿瘤焦亡，增强肿瘤免疫原性，促进DC成熟，实现体内T细胞介导的免疫激活。因此，本研究作为第一个近红外超氧化物自由基诱导的焦亡和免疫治疗系统，为焦亡增强的癌症免疫治疗提供了有价值的指导。预计这项工作也将为后续设计能够克服肿瘤缺氧的有前途的ROS发生器提供灵感，为未来高性能光活化材料的开发提供灵感。
参考文献
Lysosome-Anchoring Activation Design of Type I Photosensitizer Evokes Pyroptosis and Antitumor Immunity， Guo Li, Liuwei Gu, Chaojie Yang, Xiaojie Kong, Yuling Qin,* and Li Wu*, ACS Materials Lett. 2024, 6,1820−1830,https://doi.org/10.1021/acsmaterialslett.4c00135
