内容提要
追踪肿瘤治疗效果的定量评估对于癌症患者的精准管理至关重要。诊疗探针将诊断分子成像与治疗功能整合于单一实体中，可用于监测治疗过程并反映治疗效果。然而，由于在肿瘤治疗中采用单波长成像，当前的诊疗探针缺乏体内精确的定量评估能力。在此，我们开发了一系列双比率单分子诊疗探针，通过光热治疗（PTT）实现精准肿瘤治疗，并借助比率型近红外荧光（NIRF）和比率型光声（PA）成像在体内定量评估肿瘤细胞死亡情况。我们将一种最优的单分子染料进一步修饰为可激活探针（AF-1F-NO₂），其双比率 NIRF/PA 信号和光热活性仅在肿瘤生物标志物（硝基还原酶）存在时被激活。通过对肿瘤缺氧产生双比率响应（NIRF/PA：NIRF₈₅₀/NIRF₇₅₀；PA₇₇₀/PA₆₇₀），这种新型探针可作为缺氧激活的光热治疗诊疗剂，实现光热治疗过程中体内的实时定量评估。因此，本研究不仅首次提出了用于光热治疗和体内治疗效果实时定量评估的双比率单分子诊疗探针，还为设计其他单分子双比率诊疗探针并结合更多治疗方式用于精准医疗开辟了前景广阔的新范式。
双比率诊疗探针的分子设计与合成
具有竞争过程（荧光与非辐射衰减）的荧光团面临挑战，因为光声成像和光热治疗均依赖非辐射衰减。近红外吸收发色团的荧光淬灭会增强其光声信号。在单一染料中优化近红外荧光、光声和光热治疗性能并非易事。分子旋转会影响辐射 / 非辐射复合过程，而分子转子可通过促进能量耗散和热量产生来改善光热治疗效果。共轭结构中的苯基通过阻止顺 - 反异构化提高吸光度（ε）。染料的光吸收能力限制其输出信号，增加光子吸收可同时提高荧光和光热 / 光声效率。引入调控基团可增强光吸收和分子内运动，在保证高光热转换效率 / 光声信号的同时维持荧光特性。我们近期的研究表明，硫取代的半花菁染料具有平衡的近红外荧光 / 光声性能。在硫取代半花菁（BS-Cy-1）中引入苯基有助于开发单分子双比率近红外荧光 / 光声诊疗探针。缺氧是肿瘤微环境中的关键因素，与不良预后相关，可用于早期评估治疗反应。光热治疗的热效应可改善肿瘤内血液循环，为缺氧肿瘤区域提供更多氧气。因此，开发一种整合诊断、光热治疗和体内肿瘤治疗效果实时评估功能的双比率近红外荧光 / 光声诊疗探针是一个极具前景的目标。
为验证这一概念，我们设计并合成了四种双比率单分子染料 ——AF-0F、AF-1F、AF-TCTA 和 AF-3F。通过紫外 - 可见吸收和荧光光谱测量了它们的光学性质，这些染料和 BS-Cy-1 的光物理数据见表 S1-S5。AF-0F、AF-1F、AF-TCTA 和 AF-3F 在多种溶剂（DMF、DMSO、乙醇、乙腈和 PBS）中表现出长波长近红外吸收（720-781 nm）和发射（797-828 nm）。这些染料的摩尔消光系数显著增加，其中 AF-1F 在 PBS 中的 εmax 为 6.7×10⁴，是 BS-Cy-1（PBS 中 εmax 为 3.5×10⁴）的 1.9 倍。高摩尔消光系数有助于增强光声、光热治疗和近红外荧光成像效果。AF-1F 在 PBS 中的荧光量子产率（Φ=0.019）与 BS-Cy-1（PBS 中 Φ=0.020）相近，AF-0F、AF-TCTA 和 AF-3F 的量子产率也无明显变化。这些结果表明，在硫取代化合物中引入苯基可显著提高摩尔消光系数，且不影响荧光发射，有利于通过诊断、光热治疗和体内治疗效果定量评估实现精准肿瘤治疗。
为评估苯基引入对光声信号和光热治疗效果的影响，我们对比了 AF-0F、AF-1F、AF-3F、AF-TCTA 和 BS-Cy-1 的光热性质。经 780 nm 激光照射后，AF-0F、AF-1F、AF-3F 和 AF-TCTA 均出现显著的温度升高，显示出高效的光热效应。温度升高具有浓度依赖性，且相比 BS-Cy-1 能达到更高温度。例如，20 μM 的 AF-1F 可升至 58°C，而 BS-Cy-1 仅能达到 46°C。AF-1F 的光热转换效率（PCE）为 63%，是 BS-Cy-1（45%）的 1.4 倍。光稳定性测试证实，其在四个循环中性能保持一致。AF-1F 优异的光热性能归因于苯基增强了分子内运动和非辐射衰减。此外，AF-1F 的光声强度是 BS-Cy-1 的 1.5 倍，进一步证实了其性能优势。这些结果表明，苯基的引入增强了这类化合物的光热 / 光声性质，其中 AF-1F 的光声光谱出现红移。
通过密度泛函理论（DFT）计算发现，AF-0F、AF-1F、AF-3F 和 AF-TCTA 的最高占据分子轨道（HOMO）与最低未占据分子轨道（LUMO）能隙较窄，这意味着它们具有长近红外吸收和红移发射波长的潜力。
我们在不同 pH 环境中检测了 AF-0F、AF-1F、AF-3F 和 AF-TCTA 的性能，以模拟双比率近红外荧光和光声成像的质子化与去质子化条件。发射光谱显示，在不同 pH 条件下，780-850 nm 处的荧光增强，700-770 nm 处的荧光减弱。吸收光谱中也观察到波长偏移。这些发现表明，AF-0F、AF-1F、AF-3F 和 AF-TCTA 可用于双比率近红外荧光 / 光声成像。其中，具有优异光物理性质的 AF-1F 是实现精准肿瘤治疗（包括诊断、光热治疗和体内治疗效果评估）的理想选择。我们还以 AF-1F 为骨架，通过与 2-（溴甲基）-5 - 硝基呋喃的一锅亲核反应开发了 AF-1F-NO₂探针，用于体内光热治疗效果的实时定量评估。
AF-1F-NO₂对硝基还原酶（NTR）的双比率近红外荧光 / 光声响应及光热变化
我们通过检测不同 NTR 浓度下 AF-1F-NO₂的吸收光谱和荧光光谱，研究了其作为双比率近红外荧光 / 光声探针的响应特性。紫外 - 可见光谱显示，加入 NTR 后，最大吸收波长发生红移，770 nm 处的吸光度增强，670 nm 处的吸光度减弱。随着 NTR 浓度从 0 增至 10 μg/mL，A₇₇₀/A₆₇₀比值从约 0.57 线性增至约 1.85，表明 AF-1F-NO₂有望用于 NTR 的比率型光声传感。光声成像显示，PA₇₇₀显著增强而 PA₆₇₀减弱，且与 NTR 浓度呈强相关性（R²=0.9907）。荧光光谱显示，I₇₆₀减弱而 I₈₅₀增强，荧光比值（I₈₅₀/I₇₅₀）增加 11 倍，且与 NTR 浓度呈线性相关。这些变化源于 NTR 还原 AF-1F-NO₂中的硝基，释放出 AF-1F，这一过程经质谱验证。NTR 检测的响应限为 7.2 ng/mL。AF-1F-NO₂对 NTR 检测具有高灵敏度和特异性，与其他物质共孵育时未出现显著变化，使其有望用于 NTR 高表达肿瘤的成像。
为评估温度对 AF-1F-NO₂荧光的影响，我们测试了其在 NTR 与 NADPH 激活后的表现。25 至 40°C 的温度变化对荧光无影响，但加入 NTR 后荧光强度显著增强，在 37°C 时响应最强，表明是 NTR 激活而非温度影响荧光。
我们还通过测试不同 NTR 浓度下的响应，研究了 AF-1F-NO₂的光热敏感性。如图所示，在 780 nm 激光照射下，随着 NTR 浓度从 0 增至 10 μg/mL，20 μM 的 AF-1F-NO₂在 5 分钟内温度从 37.0°C 升至 60.0°C，呈剂量依赖性。该波长与探针激活后的 770 nm 吸收峰匹配，可增强光热转换。相比之下，650 nm 照射时，AF-1F-NO₂温度升高较显著，而经 NTR 激活的 AF-1F 温度升高较小。值得注意的是，20 μM 的 AF-1F-NO₂与 NTR 共同作用时，温度升高 27°C，显著高于单独使用 AF-1F 时的 5°C 升高。这些结果表明，NTR 激活可增强光热效应，证实该探针在特异性光热成像和光热治疗中的潜力。AF-1F-NO₂对 NTR 的选择性高、光声信号强、热效能高，为精准的缺氧激活光热治疗及基于双比率近红外荧光 / 光声成像的体内治疗实时监测奠定了基础。
AF-1F-NO₂在肿瘤细胞中对硝基还原酶（NTR）的比率型荧光成像及光热响应性
AF-1F-NO₂的光物理和光热特性使其能够实现缺氧激活的光热治疗（PTT）和硝基还原酶（NTR）的定量检测。MTT 实验显示，在测试浓度下，该探针在常氧或缺氧条件下对细胞活力均无影响，但在激光照射下，4T1 细胞的活力呈浓度依赖性降低，且在缺氧（1% 氧浓度）条件下细胞活力更低。L929 细胞也表现出类似行为，证实了 AF-1F-NO₂在缺氧条件下的细胞毒性。该探针能有效进入 4T1 和 WI-38 细胞，且在肿瘤细胞中荧光更强，这可能是由于肿瘤细胞代谢活性更高。亚细胞器定位研究表明，AF-1F-NO₂在缺氧条件下特异性靶向线粒体。
利用双光子共聚焦显微镜观察发现，缺氧条件下荧光比率（通道 2 / 通道 1）增加 50 倍，与 NTR 水平相关。光疗评估显示，缺氧条件下细胞毒性增强，与 MTT 实验结果一致。这些发现证实，AF-1F-NO₂可作为比率型 NTR 探针，用于缺氧条件下的肿瘤成像和光热治疗。
利用 AF-1F-NO₂探针通过比率型荧光成像监测缺氧激活的光热治疗诱导的细胞死亡
受 AF-1F-NO₂探针的通道 2 / 通道 1 比率与缺氧（15% 至 1% 氧浓度）存在相关性这一发现的启发，我们通过实时定量缺氧水平，评估了该探针监测光热治疗（PTT）诱导的细胞死亡的能力。共聚焦显微镜和流式细胞术结果显示，在 780 nm 激光照射下，随着氧气浓度降低，碘化丙啶（PI，红色）和绿色通道（通道 1）的荧光增强，而钙黄绿素 - AM（Calcein-AM，绿色）和红色通道（通道 2）的荧光减弱。在 1% 氧浓度下，通道 2 / 通道 1 的比率比常氧条件下低 69 倍，且随着缺氧程度加剧，细胞死亡率升高）。该比率随激光照射时间延长而降低，无激光照射时则无明显变化。在 4T1 细胞中，从 21% 氧浓度到 1% 氧浓度范围内，有无激光照射时的比率呈强相关性（r=-0.998）。这些发现表明，AF-1F-NO₂的比率型荧光可反映缺氧细胞中的 NTR 水平和光热治疗效果，能够实时监测体外光热治疗诱导的细胞死亡，为体内诊断、治疗及疗效评估提供了有价值的工具。利用双比率近红外荧光与光声单分子诊疗探针 AF-1F-NO₂在小鼠体内实现肿瘤的实时诊断、治疗及定量评估。
经过体外测试后，我们在 4T1 荷瘤小鼠中评估了 AF-1F-NO₂对缺氧的双比率近红外荧光（NIRF）和光声（PA）成像效果，并与健康后肢进行了对比。皮下注射后，肿瘤部位的荧光（F₈₅₀）和光声信号（PA₇₇₀）在 0 至 60 分钟内逐渐增强，而 F₇₅₀和 PA₆₇₀信号则逐渐减弱。健康后肢的荧光和光声信号几乎无明显变化。定量分析显示，肿瘤组织中的 F₈₅₀/F₇₅₀和 PA₇₇₀/PA₆₇₀比值逐渐升高，在注射后 60 分钟达到峰值，而健康后肢则无显著变化。在 4T1 荷瘤小鼠中，PA₇₇₀/PA₆₇₀与 F₈₅₀/F₇₅₀比值之间存在强相关性（r=-0.985）。这些结果表明，AF-1F-NO₂能够通过双比率近红外荧光 / 光声成像对肿瘤中的硝基还原酶（NTR）进行定量，并实时评估光热治疗（PTT）的疗效。近红外荧光与光声成像的比率信号可相互交叉验证。体内研究显示，AF-1F-NO₂在注射后 2 小时主要在肝脏中积累，5 小时后被代谢，这一结果通过离体近红外荧光成像得到证实，表明其具有良好的生物相容性，适合用于体内光热治疗的实时评估。
接受 AF-1F-NO₂治疗的小鼠，其肿瘤部位的光热效应导致温度显著升高，从 37.7°C 升至 59.2°C，而生理盐水处理的肿瘤部位温度升高幅度极小。光热治疗前，所有组别的肿瘤在 750 nm 和 850 nm 处的近红外荧光信号以及 670 nm 和 770 nm 处的光声信号测量值相近。
光热治疗后，肿瘤在 750 nm 处的近红外荧光信号变化极小，而 850 nm 处的近红外荧光信号显著降低。F₈₅₀/F₇₅₀比值从 1.4 降至 0.92，而 PA₇₇₀/PA₆₇₀信号保持稳定。肿瘤的双比率近红外荧光 / 光声信号具有时间依赖性，随时间显著增强。肿瘤的三维多光谱光声断层扫描（MSOT）图像显示，AF-1F-NO₂+ 激光组的 PA₇₇₀/PA₆₇₀比值随时间降低，表明光热治疗后缺氧状况得到改善。相比之下，其他组别的 PA₇₇₀/PA₆₇₀比值升高，表明肿瘤内氧气分布不均匀。肿瘤生长曲线和组织学分析证实，与其他治疗方式相比，AF-1F-NO₂+ 激光治疗能显著抑制肿瘤生长。利用近红外荧光和光声比率成像对光热治疗效果进行定量测量发现，F₈₅₀/F₇₅₀比值与肿瘤抑制率之间存在强相关性。对治疗后的肿瘤进行苏木精 - 伊红（H&E）染色发现，AF-1F-NO₂+ 近红外组的坏死区域更多，表明 AF-1F-NO₂在抑制肿瘤生长方面具有显著效果，尤其在缺氧肿瘤中。实验中未观察到小鼠体重明显下降或主要器官出现病理变化，表明 AF-1F-NO₂用于光热治疗的副作用较低。这些结果凸显了 AF-1F-NO₂在缺氧激活的光热治疗及体内肿瘤实时定量评估中的潜力。
总结
能够同时实现肿瘤诊断、治疗及疗效评估的精准肿瘤治疗至关重要。与基于组装平台和聚集体的诊疗试剂不同，本研究首次借助双比率近红外荧光 / 光声单分子诊疗探针实现了这些目标。我们通过在光热治疗（PTT）过程中检测硝基还原酶（NTR）水平，证实了这些探针在肿瘤诊断、治疗以及体内治疗效果精准评估方面的有效性。该方法融合了双比率近红外荧光 / 光声成像的优势，成功监测到光热治疗所缓解的肿瘤缺氧状况。总体而言，本研究不仅为开发用于缺氧激活光热治疗及体内治疗效果实时评估的双比率单分子诊疗探针提供了一种策略，还推出了新一代诊疗试剂，填补了在实时反馈治疗结果的定量评估领域存在的空白。
参考文献
Dual Ratiometric Single-Molecule Theranostic Probes for Photothermal Therapy and Real-Time Quantitative Evaluation of Therapeutic Efficacy In Vivo ,Shuping Zhang, Xingyue Liu, Bang-Ping Jiang, Shi-Chen Ji, Hua Chen,* and Xing-Can Shen*,Anal. Chem.,https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c02253
