内容提要
本文报告基于半花菁的荧光团族（HCL），能够将双环二氧杂环丁烷整合到半花菁骨架上，从而开发多响应荧光探针，实现的第二近红外窗口（725 - 1025 nm）的可调谐发射。选择分别在725 nm和1025 nm发射的HCL1和HCL5来构建级联可激活报告CAR，用于互连生物标志物的无串扰双链体化学发光成像。对雄性小鼠进行全身注射后，CAR优先在肝脏中蓄积并报告HIRI相关的超氧阴离子（O2·—），后者启动自我断裂并将二级报告分子KIR释放到肾脏中，报告AKI相关的N-乙酰基-β-D氨基葡萄糖苷酶（NAG）。这种机制允许CAR作为AKI报告基因逐渐释放的储存库，与共同施用单独的探针相比，提供了显著延长的成像窗口。
近红外二区化学发光团的设计、合成与表征
本文合成了双环二氧杂环丁烷（BD-1）和金刚烷基二氧杂环丁烷（AD-1），并测定了它们在室温下放置6小时后的残留化学发光。BD-OTf表现出优异的热稳定性，与AD-OTf相比，其残留化学发光强度的降低可忽略不计。随后，通过缀合呫吨鎓和吲哚鎓衍生物来定制双环二氧杂环丁烷骨架，这些衍生物具有扩展的D-π-A基序，形成刚性共轭结构。这种共轭扩展有效地调节并红移了HCL的化学发光发射，从725 nm到最大1025 nm。在二甲基亚砜/水中，HCL1-HCL5的最大吸收波长分别为652、695、755、798和822 nm。此外，HCL1-5在近红外一区（NIR-I）和近红外二区（NIR-II）区域均表现出强烈的化学发光，最大发射峰分别为725、735、850、920和1025 nm，与其荧光光谱吻合良好，表明它们具备近红外化学发光和荧光成像的能力。在HCLs中，HCL1和HCL5的发射波长分别为725 nm和1025 nm，二者光谱重叠可忽略不计。选择HCL1和HCL5用于后续单分子双响应探针的构建。
CAR的合成及体外表征
合成CAR和两种对照探针，即肝损伤报告探针（LIR）和肾损伤报告探针（KIR）。CAR的两亲性使其能够自发组装成球形纳米颗粒，测得CAR的平均水动力尺寸约为180nm，将其在磷酸盐缓冲溶液（PBS）或胎牛血清（FBS）中储存5天。不同pH缓冲溶液中，未检测到CAR的沉淀和荧光的明显变化。zeta电位测量显示CAR带负电荷。CAR在约650nm和800nm处有两个吸收峰，分别对应HCL1和HCL5部分的吸光度。CAR本身无化学发光和荧光，因为HCL1和HCL5部分均处于“笼蔽”状态，芳香羟基的给电子能力减弱。暴露于KO2和NAG后，CAR在约700nm和820nm处显示出红移的吸收峰。在NAG存在下，CAR的近红外一区化学发光和荧光分别增加约8500倍和8倍。类似地，与KO2孵育后，近红外二区化学发光和荧光分别增加约6500倍和7.5倍。这种显著的发射增强归因于NAG对N-乙酰-β-D-葡萄糖胺部分的糖苷键的切割以及O2·—对三氟甲磺酸酯基团的切割，这触发了1,4-消除反应并导致其断裂为未笼蔽的探针FL1R和FL2R，两者的发光团上均具有强给电子酚盐基团。这种碎片化通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）得到验证，结果表明CAR在暴露于KO2后尺寸减小至约30 nm和4 nm。其他活性氧、金属离子和其他酶在内的干扰分析物存在时，CAR化学发光和荧光变化极小，证实其具有优异的稳定性和特异性。此外，NAG对CAR的催化效率（Kcat/Km）经计算为0.85 μM-1 S-1。近红外二区化学发光信号与KO2浓度之间存在良好的线性关系，估计检测限（LOD）约为12 nM。CAR化学发光半衰期约为12分钟，适合体内成像。
单分子双响应探针CAR对HIRI和HIRI诱导的AKI进行级联多重成像和尿液分析
在活体小鼠中评估了CAR在HIRI及HIRI诱导的AKI实时无创成像中的性能。建立部分肝脏热缺血模型。雄性小鼠麻醉后打开腹腔，解剖小叶间韧带。然后使用微血管夹阻断左外侧和正中肝叶的动脉和门静脉血供，持续15、30、45或60分钟。之后移除血管夹并关闭腹腔。这种手术过程导致节段性（约70 %）肝脏缺血。采用相同手术流程建立假手术组，仅造成腹部创伤而不进行血管阻断。将健康小鼠或术前给予抗氧化药物（N-乙酰半胱氨酸（NAC））的小鼠作为对照组。再灌注后4小时注射CAR后进行纵向化学发光成像。对于经历15分钟和30分钟肝脏缺血的小鼠，注射CAR导致肝脏中NIR-II化学发光信号逐渐增加，在注射后30分钟达到峰值。CAR的这种肝脏激活表明在HIRI进展过程中O2·—上调。在该时间点，NIR-II化学发光信号分别比对照小鼠高15.2倍和17.3倍。然而，在经历15分钟和30分钟肝脏缺血的小鼠肾脏中未观察到明显的NIR-I化学发光信号，表明在这些条件下肾脏未受影响。对于经历45分钟和60分钟肝脏缺血的小鼠，其肝脏的近红外二区化学发光信号变化趋势相似，在注射CAR后30分钟时，分别比对照组高26.5倍和41.2倍。在肾脏中观察到明亮的近红外一区化学发光信号，这反映了被释放的KIR检测到的NAG上调，表明发生了与肝缺血再灌注损伤相关的急性肾损伤。即使在注射CAR后60分钟，肾脏中的信号仍然可检测到。在注射CAR后30分钟，经历45分钟和60分钟肝脏缺血的小鼠肾脏信号分别比对照组高32.4倍和42.6倍。相比之下，当小鼠预先用NAC处理以保护肝脏免受缺血再灌注损伤时，肝脏的近红外二区化学发光信号和肾脏的近红外一区信号分别降低了4.8倍和1.2倍。尽管超氧阴离子与物理创伤中的病变形成有关，但仅接受腹部创伤的假手术小鼠在肝脏和肾脏中的化学发光增加可忽略不计，这表明CAR对肝缺血再灌注损伤的报告具有高特异性，而非其他损伤。这应归因于CAR在肝脏的定向蓄积，导致探针在其他创伤组织中的蓄积极少。体内荧光成像和离体生物分布研究进一步证实了这一观察结果。此外，由于没有组织自身荧光，CAR的化学发光成像在注射后45分钟和60分钟时的信噪比分别比荧光成像高约4.5倍和4.2倍。
结论
本研究开发了一种单分子双响应化学发光探针，该探针具有无串扰、超长发射和可切换药代动力学特性，可用于两种相互关联疾病的同时诊断。这种灵活的分子设计可轻松调整以检测多种生物标志物，不仅扩展了用于检测肝-肾轴以外相互关联疾病的探针类型，还有助于在临床环境中更准确、更早地诊断这些疾病。
参考文献
Unimolecular near-infrared chemiluminescent reporter for cascaded multiplex imaging of ischemia-reperfusion injury in the liver-kidney axis, Bankang Ruan, Weiliang Deng, Jingjing Che, Shujuan Yi, Jie Liu, Weiping Xu, Yuyan Jiang, Ya zhou, Pan Xie, Huhai Zhang, Hongwen Zhao, Jiaguo Huang, Nat. Commun. 2025, 16, 7743. https://doi.org/10.1038/s41467-025-62348-y
