内容提要
本文设计并合成了两个恶嗪衍生物JSO和JDO。通过刚性久洛尼定部分取代恶嗪1的二乙氨基供体基团。这种结构修饰有效地增强了给电子能力，抑制了非辐射衰变，改善了膜的通透性。与恶嗪 1相比，JDO的发射波长红移(703 nm)，荧光量子产率提高2倍。JDO还具有良好的胞内积累、pH稳定性和光稳定性。由此开发一种新型过氧亚硝酸根(ONOO—)响应型探针，通过破坏荧光团的共轭结构，JDO-ONOO发出超低本底荧光，在ONOO—存在下，荧光切换到“开启”模式，强度增加130倍。该探针在生理条件下具有灵敏度高(LOD=3.7 nM)、响应速度快、选择性好等特点，成功地应用于活细胞中ONOO—荧光成像和多种小鼠炎症模型。
荧光团的设计和光物理性质
恶嗪 1是一种经典的近红外荧光团，具有平面共轭体系，良好的pH和光稳定性。它的中心氮原子可被修饰，成为构建可激活荧光探针的支架。但恶嗪1含有二乙氨基，其给电子能力有限，限制了π电子离域程度和发射光谱红移。其次，二乙氨基的柔性烷基在分子内旋转和振动，促进非辐射衰变，导致荧光量子产率降低。短疏水链对亲脂性贡献很小，导致膜通透性不佳，细胞摄取效率低下。本文在恶嗪1核中引入久洛尼定，这是一种刚性的环胺，因其强大的供电子能力和低构象灵活性而闻名。设计策略基于以下三个考虑因素。(1)电子效应：与二乙胺相比，久洛尼定具有更强的给电子能力，这是因为稠环结构稳定了氮原子上的孤对电子。久洛尼定的掺入增加了给体位置的电子密度，增强了激发时的分子内电荷转移(ICT)。这种电子分布调整导致吸收和发射波长显著红移，使染料更适于深层组织成像;(2)结构刚性：与柔性二乙氨基不同，久洛尼定具有刚性的多环结构，在激发态分子内转动和振动较小。这种构象约束有效地降低了非辐射衰变的几率，促进辐射跃迁，从而提高荧光量子产率;(3)疏水性和细胞膜通透性：与二乙胺相比，久洛尼定具有更大的分子体积和疏水表面积，有助于增加亲脂性，从而增强染料穿透细胞膜的能力，提高成像亮度和传输效率。本文合成了两种新的恶嗪类化合物，并系统地研究了久洛尼定取代对其光物理性质的影响。JSO在一个位置上含有一个久洛尼定单元，而JDO在两个位置上都以对称的方式含有久洛尼定基团。这种从单取代到二取代的结构能够对电子供体强度和共轭程度进行调节。UV—Vis吸收和荧光发射。研究了JSO和JDO在不同溶剂中的吸收光谱和荧光光谱。恶嗪 1的最大吸收波长为650 nm，最大发射波长为683 nm。JSO和JDO在水溶液中的光谱都发生了显著的红移。在JDO中观察到最大的位移，最大吸收为670 nm，最大发射为703 nm。在水溶液中，恶嗪 1、JSO和JDO的Φ分别为0.077、0.127和0.155。量子产率的提高可能归因于久洛尼定的引入，它限制分子内的旋转和激发态的振动，有效地抑制了非辐射衰变，辐射效率提高导致更大的荧光亮度。亲脂性评估(logP)。为了评估疏水性，测量每种染料的辛醇−水分配系数。与恶嗪 1相比，JSO和JDO的logP值分别高出1.36倍和3.19倍。这一结果与引入更大、更疏水久洛尼定的预测是一致的，有助于增加膜通透性和细胞内递送效率。
细胞摄取和成像性能
为检测细胞内分布，将细胞与5 μM的每种染料孵育20 min，然后进行共聚焦荧光成像。恶嗪 1表现出较弱的细胞内信号，表明摄取较差。相反，JDO显示出最明亮的荧光，细胞内分布均匀。JSO产生了中等的信号水平。用流式细胞仪对荧光强度进行进一步定量，JDO组的荧光强度明显高于JSO组和恶嗪 1。久洛尼定取代可以显著提高荧光团的光谱性质、亮度、细胞摄取和成像对比度。在两种衍生染料中，JDO显示出最有希望的轮廓，因此被选为后续探针开发的支架。
探头平台的概念验证
本文选择ONOO—作为模型目标，设计可激活的探测器JDO-ONOO。在JDO的中心氮位置引入了苯基硼酸，有效地扰乱了电子离域途径，并在未反应状态下抑制了荧光。ONOO—的光谱响应。当将ONOO—(50 μM)添加到PBS溶液(10 μM JDO-ONOO，pH 7.4)，最初无色和非荧光的探针溶液迅速变为蓝色，并分别在670 nm和703 nm处出现明显的UV−Vis吸收和荧光发射峰。这些显著的光谱变化表明，ONOO—有效地裂解了苯基硼酸，导致母体荧光团JDO的释放和其扩展的共轭体系的恢复。混合物反应后的质谱分析证实了JDO的形成，其特征分子离子峰的出现证明了这一点。这一观察结果为荧光团回收机制提供了直接证据。这种结构重组确保了仅在特定激活时才发生荧光发射，从而产生最小的本底荧光。定量检测性能。通过用不同浓度的ONOO—滴定，进一步评价了该试剂的定量检测性能。随着ONOO—浓度的增加，其吸收强度和荧光强度均呈正比增加，且具有良好的线性关系。计算的检测下限为5.1 nM(吸收)和3.7 nM(荧光)，表明该探针具有很高的灵敏度并且适合定量检测。鉴于生物系统中的各种活性物质可能会干扰探针，我们进行了实验以确定JDO-ONOO的选择性。结果表明，只有与ONOO—孵育后，JDO-ONOO的荧光才有显著增强，表明JDO-ONOO对ONOO—具有良好的选择性。JDO-ONOO具备高性能可激活荧光探针的所有特征：低本底、高信噪比、快速和灵敏的响应以及出色的选择性。
细胞和动物模型中的探针验证
为了确认在细胞中的ONOO—反应性，我们进行了经典的供体-清除剂实验。用3-吗啉-赛诺酮亚胺盐酸盐(SIN-1)生成外源性ONOO—，尿酸(UA)作为ONOO—清除剂。SIN-1处理导致细胞内荧光显著增加，而尿酸预处理显著减弱该信号。这些结果证实了在细胞环境中，JDO-ONOO的荧光激活是由ONOO—特异性地介导的。我们进一步应用JDO-ONOO检测内源性ONOO—在内毒素诱导的炎症细胞模型中的产生。与未经处理的细胞(对照组)相比，内毒素刺激的细胞的荧光信号显著增强，这表明炎症状态下ONOO—水平升高。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)的处理导致荧光强度大幅降低，这进一步验证了探针对ONOO—含量波动的响应。
我们应用JDO-ONOO在三个涉及ONOO—失调的疾病模型中检测ONOO—，包括类风湿性关节炎(RA)、药物性肝损伤(DILI)和溃疡性结肠炎(UC)。Ra模型。在λ-卡拉胶诱导的RA小鼠模型中，关节内注射JDO-ONOO。与健康对照组相比，炎症关节中的荧光信号显著增强。荧光信号的增加反映了炎症过程中ONOO—的局部积聚。甲氨蝶呤(MTX)是一种治疗类风湿关节炎的临床常用药物，治疗后荧光强度显著降低。这些发现表明，JDO-ONOO可以有效地监测炎症组织中ONOO—，并评估治疗干预的有效性。在对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝损伤模型中，成功地将JDO-ONOO用于肝脏ONOO—升高的实时成像。与对照组相比，DILI组小鼠肝脏中的荧光强度显著增加，这与已知的由于肝细胞损伤而导致ONOO—升高的情况一致。在NAC治疗后，肝脏荧光减弱表明ONOO—水平显著降低。体外成像进一步证实了肝脏定位的荧光。H&E染色组织学分析表明，ONOO—水平的变化与组织损伤和恢复的程度相关。在葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中，JDO-ONOO显示炎症结肠组织中ONOO—含量显著上调。给予环孢素A(CsA)后，荧光强度显著降低，与治疗后抑制ONOO—的产生一致。体外成像进一步显示荧光仅定位于结肠区域，H&E染色证实CsA介导了组织病理损伤的减轻。
结论
本文设计并合成了两个恶嗪衍生物，JSO和JDO，解决了恶嗪1的主要局限性，包括发射波长短、荧光量子产率低和细胞摄取差。这些荧光团继承了恶嗪1的高pH稳定性和光稳定性，同时获得了三种新的增强的光物理性质：显著的红移荧光发射(高达703 nm)，提高荧光量子产率，增强亲脂性，改善细胞摄取。在两种荧光团中，JDO具有最好的光学和生物学性能，因此被选为构建下一代低本底探测平台的原型支架，进一步设计并合成了一种过氧亚硝酸根响应的可激活荧光探针JDO-ONOO。通过选择性地修饰其中心氮原子来破坏共轭体系，JDO-ONOO在激活前表现出“零本底”荧光，但在被ONOO—激活时产生强烈的开启荧光信号。
参考文献
Universal Low-Background Fluorophore Platform via Structural Reprogramming of Oxazine 1 with Julolidine for Activatable Probe Design, Dianfeng Dai, Zhimin Zhang, Mo Ma, Chen Zhao, Jingkang Li, Siqi Zhang, Pinyi Ma,* Bo Zhang,*and Daqian Song*, Anal. Chem. 2025, 97, 21071−21078. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c04331
