内容提要
噁嗪1是一种可修饰的近红外荧光团，可用于开发低背景荧光探针。它存在诸如红移发射不足、荧光量子产率低以及细胞摄取差等局限性。为了解决这些问题，我们通过替换二乙氨基供体,设计并合成了两种新的噁嗪衍生物JSO和JDO。刚性二氢吲哚啉基团的1号噁嗪衍生物。这种结构有效地增强了电子供体能力，从而促进了压电非辐射衰减和改善的膜通透性。与噁嗪1相比，JDO的发射波长红移（703纳米），其荧光量子产率提高了2倍。JDO还具有优越的细胞内积累能力以及出色的pH稳定性和光稳定性。我们开发了一种新型过氧亚硝酸盐(ONOO−)-responsive探针JDO-ONOO，作为概念验证来验证该设计平台。通过破坏荧光团的共轭结构，JDO-ONOO发出极低背景荧光，在存在ONOO−时，荧光切换为“开启”模式，强度增加130倍。该探针具有高灵敏度（检测限=3.7纳摩尔）、快速响应和在生理条件下出色的特异性。
荧光团的设计
我们将具有强电子给体能力和低构象灵活性的刚性环状胺——呫吨啶引入到噁嗪1核心结构中。设计策略基于以下三个考虑因素：（1）电子效应：由于共轭环结构稳定了氮原子上的孤对电子，呫吨啶的电子给体能力比二乙胺更强。引入呫吨啶增加了给电子部位的电子密度，并在激发时增强了分子内电荷转移（ICT）。这种电子分布的调节导致吸收和发射波长显著红移，使染料更适合深组织成像。（2）结构刚性：与柔性二乙氨基基团不同，呫吨啶具有刚性多环结构，在激发态下分子内旋转和振动程度低。这种构象约束有效降低了非辐射衰减的概率，促进了辐射跃迁，从而提高了荧光量子产率。（3）疏水性和细胞膜通透性：与二乙胺相比，朱利啶单元具有更大的分子体积和更大的疏水表面积。这些特性有助于提高亲脂性，从而增强染料穿透细胞膜的能力，促进其在细胞内的积累。这种增强的膜通透性能够提高成像亮度和传递效率。基于这一策略，合成了两种新型噁嗪衍生物，并系统评估了朱利啶取代基对其光物理性质的影响。JSO在单个位置含有一个朱利啶单元，而JDO在两个位置对称地含有朱利啶基团。这种从单取代到双取代的结构演变使得给电子强度和共轭程度能够实现剂量依赖性调节。
光物理和光动力学性质
我们通过系统地研究和比较，对噁嗪1、JSO和JDO的光物理性质进行了评估。结果表明，取代的朱利啶有效地扩展了π共轭体系并增强了分子内电荷转移（ICT），从而改善了光谱特性，使其适用于体内成像应用。量子产率的提高可能归因于由朱利啶基团引入的刚性，这种刚性通过限制激发态下的分子内旋转和振动有效地抑制了非辐射衰减途径。辐射效率的提高导致了更强的荧光亮度。与氧嗪1相比，JSO和JDO的logP值分别高出1.36倍和3.19倍。这一结果与引入了更大、更疏水的朱利啶基团相符，这些基团有助于提高膜通透性并增强细胞内递送效率。JSO和JDO均具有出色的pH耐受性和光稳定性。在pH值3.0至9.0范围内以及持续光照条件下，其发射强度未发生显著变化，荧光信号也保持稳定。这些结果表明，取代基为julolidine对染料的光稳定性没有影响，进一步证明了它们在活细胞和体内成像中的适用性。
概念验证探针平台
基于JDO优越的光物理和生物特性，我们旨在展示其作为构建下一代低背景荧光探针通用支架的潜力。关键的设计原则是对其进行功能化处理。通过将荧光团的中心氮原子与淬灭基团相连，破坏共轭π体系，从而在激活前实现完全淬灭、零背景的荧光团。当与特定分析物相互作用时，淬灭基团被切割，共轭结构得以恢复，荧光被激活（“开启”响应）。这种策略不仅消除了背景信号，还显著提高了信噪比，因此是检测分析物的一种稳健框架。为了验证这一概念，我们选择了ONOO−as一种模型目标，并设计了可激活探针JDO-ONOO。ONOO−is是一种参与多种炎症病理过程的高度反应性氮物种，使其成为具有生物相关性和检测挑战性的分析物。对于识别元件，我们在JDO的中心氮位引入了苯硼酸，这是一种众所周知的ONOO−-responsive基团。这种取代有效地破坏了电子离域路径，并在未反应状态下抑制了荧光。这种结构重组确保了荧光仅在特定激活时才发出，从而产生极低的背景荧光；该探针具有高灵敏度和定量检测的适用性。时间依赖性荧光测量表明，在添加ONOO−后几分钟内荧光强度达到稳定平台期，这表明反应动力学迅速。这种快速响应对于动态生物系统中的实时检测至关重要。此外，该探针在持续激发下能够保持光稳定性，并在较宽的pH范围（pH3.0-9.0）内保持光谱稳定性，这证实了其在各种生理环境中的稳健性。
细胞和动物模型中的探针验证
我们接下来评估了JDO-ONOO在活体成像中的适用性。与未处理的细胞（对照组）相比，LPS刺激的细胞的荧光信号显著增强，这表明在炎症条件下ONOO−levels升高。使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理后，荧光强度显著降低，这进一步证实了该探针能对ONOO−content的波动做出响应。这些发现表明，JDO-ONOO能够可靠且灵敏地检测活细胞中ONOO−content的动态变化；因此，它是一种很有前景的炎症监测和药物评估工具。
为了将其应用拓展到活体环境中，我们将JDO-ONOO应用于检测ONOO−in三种涉及ONOO−dysregulation的疾病模型，包括类风湿性关节炎（RA）、药物性肝损伤（DILI）和溃疡性结肠炎（UC）。类风湿关节炎模型。在λ-角叉菜胶诱导的小鼠类风湿关节炎模型中，关节内注射JDO-ONOO后，炎症关节的荧光信号显著增强，与健康对照组相比差异明显。荧光信号的增强反映了炎症的局部积聚。使用甲氨蝶呤（MTX）治疗，这是一种临床上常用的类风湿关节炎治疗药物，导致荧光强度显著降低。这些发现表明，JDO-ONOO能够有效监测炎症组织，并评估治疗干预的效果。在对乙酰氨基酚（APAP）诱导的小鼠肝损伤模型中，JDO-ONOO成功用于实时成像检测肝脏中的ONOO−elevation。与对照组相比，DILI小鼠肝脏中的荧光强度显著升高，这与已知的ONOO−due在肝细胞损伤中的升高情况一致。经NAC治疗后，肝脏中的荧光显著减弱，体外成像进一步证实了肝脏局部的荧光现象。
结论
本研究报道了一种荧光团工程策略，通过引入朱利啶作为电子供体单元，解决了噁嗪1存在的发射波长较短、荧光量子产率低以及细胞摄取差等关键问题。通过结构修饰，我们成功开发了两种新型噁嗪基染料：JSO（单朱利啶）和JDO（双朱利啶）。这些荧光团继承了噁嗪1的高pH稳定性和光稳定性，同时获得了三个新的、增强的光物理特性：（i）显著的红移荧光发射（高达703纳米），（ii）荧光量子产率显著提高，（iii）细胞摄取显著改善（由于亲脂性增强）。在这两种荧光团中，JDO具有最理想的光学和生物学性能，因此被选为构建下一代低背景探针平台的原型支架。作为概念验证，我们设计并合成了JDO-ONOO，一种过氧亚硝酸盐响应的可激活荧光探针。通过选择性地改变其中心氮原子以破坏共轭体系，JDO-ONOO在激活前表现出“零背景”荧光，但在激活后会产生强烈的荧光信号。该探针具有出色的灵敏度（检测限低至3.7nM）、快速的动力学和在各种复杂生物基质中的高选择性。这些特性验证了所提出的基于共轭破坏和恢复的设计策略的有效性。值得注意的是，选择ONOO−was作为代表性的目标来验证基于JDO的平台的性能。本研究的创新之处不仅在于ONOO−detection，还在于建立了一种通用策略，用于开发具有极低背景信号的高性能可激活荧光探针。所开发的JDO荧光团是一种模块化、稳健且通用的支架，可轻松连接到针对其他生物靶点的其他识别部分。我们希望这项工作能够激发其他低荧光背景成像工具的开发，从而广泛应用于诸如早期疾病诊断、病理生理过程的实时监测以及治疗效果评估等领域。
参考文献
UniversalLow-Background Fluorophore Platform via Structural Reprogramming of Oxazine1 with Julolidine for Activatable Probe Design，DianfengDai ,ZhiminZhang, MoMa, ChenZhao, JingkangLi, SiqiZhang, PinyiMa, BoZhang, andDaqianSong, Ana. Chem., 2025, 97, 21071. DOI:10.1021/acs.analchem.5c04331.
