内容提要
本研究创新性地将传统的吡啶半花菁荧光团改造为喹啉半花菁结构，通过延长的共轭和增强的电子离域实现了荧光发射波长的红移。系统的位点筛选确定磷酸二苯酯为最佳反应位点，表现出优异的特异性，通过亲核取代反应将优化的荧光团与反应位点偶联，成功地制备了一种新型的比率荧光探针zt-4为了研究骨关节炎（OA）和DILI之间的信号通路。我们首先验证了zt-4在复杂炎性OA模型中的成像性能。我们应用zt-4探针从细胞和小鼠两个水平分析了铁凋亡介导的DILI模型，首次揭示了铁凋亡通路在DILI中动态调节ONOO-水平，阐明了其分子机制。
探针的紫外-可见光谱与荧光光谱
我们首先在磷酸盐缓冲液 / 乙腈（体积比 1:1）混合体系中，评估了四种探针（zt-1 至 zt-4）对过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）的光谱响应特性。紫外 - 可见吸收光谱和荧光光谱分析显示，仅有 zt-3 和 zt-4 表现出显著的 ONOO⁻响应特性。与 ONOO⁻反应后：zt-3 的最大吸收波长从 560 nm 蓝移至 465 nm，zt-4 的最大吸收波长从 630 nm 蓝移至 470 nm；zt-3 的发射峰从 715 nm 蓝移至 560 nm，zt-4 的发射峰从 740 nm 蓝移至 600 nm。值得注意的是，zt-1 和 zt-2 未表现出 ONOO⁻响应活性，我们认为这是由于它们的分子结构（尤其是噻吩酯和硼酸酯官能团）中电子离域能力不足所致。与之相反，zt-3 和 zt-4 以磷酸二苯酯作为反应位点，该位点具有更优异的电子离域特性，能够实现对 ONOO⁻的快速识别与响应。
探针检测限（LOD）的测定
我们选择 zt-3 和 zt-4 进行检测限评估。通过逐步添加 ONOO⁻（浓度范围 0-110 μmol/L）建立浓度梯度，光谱分析显示：近红外区域的荧光强度逐渐降低，同时 zt-3 在 560 nm 处、zt-4 在 600 nm 处的发射强度显著增强。这种反向相关性从定量角度证实了它们出色的比率检测能力。在 10-70 μmol/L 的 ONOO⁻线性范围内，以荧光强度对浓度绘制标准曲线，结果显示两者均具有良好的线性相关性（zt-3 的 R²=0.99091；zt-4 的 R²=0.9872）。采用 3σ/K 法计算得出，zt-3 的检测限为 58 nmol/L，zt-4 的检测限为 77 nmol/L。
细胞共聚焦成像研究
依托 zt-4 优异的体外 ONOO⁻检测能力，我们系统地探究了其在细胞层面的应用。通过 CCK-8 法进行的初步细胞毒性评估显示，在正常肝细胞系（7702 细胞）中，zt-4 具有良好的生物相容性：当探针浓度高达 30 μmol/L 时，细胞经 24 小时孵育后的存活率仍超过 90%。这些结果有力地证实了 zt-4 在细胞成像应用中的生物安全性。我们还开展了线粒体共定位实验，结果表明该探针具有出色的线粒体靶向能力。我们进一步研究了 zt-4 在 7702 细胞中对内外源性 ONOO⁻的响应情况：以 SIN-1（3 - 吗啉代斯德酮亚胺盐酸盐）作为外源性 ONOO⁻供体，通过脂多糖（LPS）和佛波醇 12 - 肉豆蔻酸 13 - 乙酸酯（PMA）诱导氧化应激，从而产生内源性 ONOO⁻。与仅加入探针的对照组中微弱的绿色通道信号相比，经SIN-1 孵育的细胞绿色通道荧光强度显著增强，同时探针红色通道的荧光强度大幅降低。在 LPS/PMA 诱导的内源性 ONOO⁻成像实验中，也观察到了一致的结果，这表明 zt-4 对体外添加和细胞内生成的 ONOO⁻均具有可靠的检测能力。最后，我们采用不同浓度的 LPS 和 PMA（0-40 μmol/L）进行浓度梯度实验，以评估 zt-4 在不同氧化应激水平下对内源性ONOO⁻ 成像的灵敏度。结果显示，随着氧化应激程度的加剧，绿色通道荧光强度显著增加，而探针红色通道的信号则大幅降低。这些结果进一步证实了 zt-4 的高灵敏度和优异响应性，表明其在细胞水平的 ONOO⁻成像中具有出色的性能。
探针 zt-4 在铁死亡细胞模型中的激光共聚焦显微镜成像
凭借 zt-4 在细胞成像实验中展现的优异灵敏度，我们将其应用于铁死亡相关研究。铁死亡是一种与线粒体相关的调控性细胞死亡途径，主要由铁稳态失衡和过量脂质过氧化驱动。在铁死亡进展过程中，谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）水平显著降低，导致活性氧（ROS）积累，进而引发细胞死亡。我们以 7702 细胞为研究对象，使用铁死亡诱导剂 Erastin 构建铁死亡模型，并采用铁死亡抑制剂 Fer-1 和 Lip-1 进行干预实验，以调节细胞的铁死亡状态。实验结果显示，铁死亡诱导组的绿色通道荧光强度显著增强，同时探针红色通道信号大幅减弱；相反，Fer-1 和 Lip-1 干预组则呈现出相反的响应模式。这些发现证实了zt-4 能够动态监测铁死亡过程中 ONOO⁻的变化，进一步验证了其高灵敏度检测特性。
探针 zt-4 在铁死亡介导的药物性肝损伤细胞模型中的激光共聚焦显微镜成像
基于 zt-4 在上述细胞实验中出色的成像能力，我们进一步将其应用于铁死亡介导的药物性肝损伤（DILI）细胞模型研究。我们采用高剂量对乙酰氨基酚（APAP）在 7702 细胞中构建了 DILI 模型。研究发现，与 APAP 组相比，Fer-1 和 Lip-1 孵育组的绿色通道荧光强度显著下调，而红色通道荧光强度部分恢复。实验结果表明，铁死亡抑制剂可通过降低 ROS 水平有效抑制铁死亡过程，进而对 DILI 发挥调控作用。此外，通过对对照组和 APAP 组进行蛋白质印迹（WB）分析，进一步证实了 DILI 与铁死亡之间的生物学关联。
探针zt-4在小鼠骨关节炎模型中的体内荧光成像
依托zt-4在细胞实验中的优异表现，我们系统评估了其对小鼠骨关节炎（OA）的实时动态成像能力，以验证其在炎症微环境中可视化检测的应用效果。在角叉菜胶诱导的 OA 模型组中，荧光强度在20分钟内达到峰值，并稳定维持40分钟；相比之下，对照组在60分钟内荧光强度保持相对稳定，且模型组的荧光强度是对照组的4.59倍。病理组织学分析显示，模型组出现滑膜细胞丢失和淋巴细胞浸润，但软骨结构保持完整，与关节炎早期特征相符。值得注意的是，zt-4探针在活体小鼠的生理环境中表现出良好的稳定性。这些结果表明，zt-4探针对关节炎病灶中 ONOO⁻的波动具有高灵敏度，能够动态监测早期关节炎的进展。
探针zt-4在铁死亡介导的药物性肝损伤小鼠模型中的体内荧光成像
基于zt-4在OA模型中已证实的高成像灵敏度和优异稳定性，我们成功构建了相应的铁死亡介导 DILI 小鼠模型。通过腹腔注射APAP建立模型组，以腹腔注射磷酸盐缓冲液（PBS）的小鼠作为对照组；模型+Fer-1组则在建模前对小鼠进行了14天的Fer-1预处理。模型构建完成后，通过尾静脉注射zt-4探针，并利用小动物成像系统监测120分钟内肝脏区域的荧光强度变化。结果显示，与模型组相比，模型+Fer-1组的荧光强度显著降低；模型组的荧光强度是对照组的2.73倍，而模型+Fer-1组的荧光强度较模型组降低了0.96倍。这些实验结果验证了我们此前在7702细胞DILI模型中的发现。为确认模型构建成功，我们对小鼠肝脏组织进行了苏木精-伊红（H&E）染色病理分析。组织学检查显示，APAP组出现明显的门静脉淤血和细胞坏死，而APAP+Fer-1组的损伤程度相对较轻。这些发现表明，抑制铁死亡通路可有效减轻药物诱导的肝损伤，进一步证实了DILI与铁死亡之间密切的生物学关联。
结论
我们创新性地构建了喹啉半花菁染料平台，并通过对反应位点和荧光团结构的系统优化，成功开发出近红外比率荧光探针zt-4。该探针具有高灵敏度、优异的信噪比和大斯托克斯位移等优势。值得注意的是，zt-4不仅在骨关节炎模型中实现了高灵敏度成像，还成功应用于铁死亡介导的药物性肝损伤的细胞模型和体内模型研究。本研究首次揭示了药物性肝损伤与铁死亡之间的机制关联。
参考文献
Electronic cloud-regulation strategy enabling rapid and sensitive near-infrared detection of ONOO⁻ for dynamic monitoring of ferroptosis-mediated drug-induced liver injury，Yongchuang Li, Haiyue Liu, Yuru Liu, Shaowei Wang*, Caixia Yin*,Fangjun Huo*，Nano Today, 2026, 66, 102900. https://doi.org/10.1016/j.nantod.2025.102900
