内容提要
我们提出了一个双比率单分子消融探针用于通过光热疗法(PTT)进行精确的肿瘤治疗，并通过比率近红外荧光(NIRF)和比率光声成像(PA)定量评估体内肿瘤细胞的死亡。一种最理想的单分子染料被进一步修饰成可激活的探针(AF-1F-NO2)，其双重比率NIRF/PA信号和光热活性仅在肿瘤生物标记物(硝基还原酶)存在的情况下被激活。通过引发对肿瘤缺氧的双重比率反应(NIRF/PA：NIRF850/NIRF750；PA770/PA670)，新的探针充当缺氧激活的PTT治疗试剂，使在PTT期间能够进行体内实时定量评估。
结果与讨论
双比率治疗诊断探针的分子设计和合成
开发一种双比率NIRF/PA治疗诊断探针，将诊断、PTT和体内肿瘤治疗结果的实时评估结合起来是一个有前途的目标，因此，设计并合成了四种双比率单分子染料：AF-0F、AF-1F、AF-TCTA和AF-3F。通过紫外可见吸收和荧光光谱测量它们的光学特性，这些染料和BS-Cy-1的光物理数据如表S1−S5所示。AF-0F、AF-1F、AF-TCTA和AF-3F在各种溶剂（DMF、DMSO、EtOH、MeCN和PBS）中表现出长波长NIR吸收（720−781nm）和发射（797−828nm）。这些染料的摩尔消光系数显着增加，其中AF-1F（PBS中的εmax=6.7×104）比BS-Cy-1（PBS中的εmax=3.5×104）高1.9倍。高摩尔消光系数可增强PA、PTT和NIRF成像。AF-1F（PBS中Φ=0.019）的荧光量子产率与BS-Cy-1（PBS中Φ=0.020）相似，AF-0F、AF-TCTA和AF-3F的变化最小。这些研究结果表明，在硫取代化合物中引入苯基可显着提高摩尔消光系数，而不影响荧光发射，有利于通过诊断、PTT和体内定量治疗评估进行精准肿瘤治疗。为了评估苯基引入对PA信号和PTT效果的影响，我们比较了AF-0F、AF-1F、AF-3F、AF-TCTA和BS-Cy-1的光热性能。780nm激光照射后，AF-0F、AF-1F、AF-3F和AFTCTA的温度显着升高，表现出高效的光热效应。温度升高与浓度相关，与BS-Cy-1相比，达到了更高的温度。例如，AF-1F在20μM时达到58°C，而BS-Cy-1仅达到46°C。AF-1F的PCE为63%，是BSCy-1(45%)的1.4倍。光稳定性测试证实了四个周期内性能的一致性。AF-1F优异的光热性能归因于苯基，它增强了分子内运动和非辐射衰变。因此，AF-1F的光声强度比BS-Cy-1高1.5倍。苯基的引入增强了这些化合物的PTT/PA特性，其中AF-1F在光声光谱中显示出红移。
双比率NIRF/PA和AF-1F-NO2对NTR响应的光热变化。我们通过检查AF-1F-NO2在不同NTR浓度下的吸收和荧光光谱，测试了AF-1F-NO2作为双比率NIRF/PA探针的响应特性。紫外可见光谱显示添加NTR后λmax发生红移，770nm处的吸光度增加，670nm处的吸光度减少。随着NTR浓度从0升至10μg/mL，A770/A670比率从∼0.57线性增加到∼1.85，表明AF-1FNO2对NTR进行比例PA传感的潜力。PA成像显示PA770显着增加，PA670显着减少，具有很强的相关性(R2=0.9907)。荧光光谱显示I760减少，I806增加，荧光比（I806/I760）增加11倍，并且与NTR浓度呈线性相关（R2=0.9917）。这些变化是由NTR还原AF-1F-NO2中的硝基导致的，导致AF-1F释放，经质谱分析证实。NTR检测的响应限7.2ng/mL。AF-1FNO2对NTR检测表现出高灵敏度和特异性，与其他物种一起孵育时没有显示出显着变化。这使得AF-1F-NO2有希望用于NTR水平升高的肿瘤成像。
为了评估温度对AF-1F-NO2荧光的影响，我们测试了用NADPH激活NTR后的行为。25至40°C的温度变化对荧光没有影响。然而，添加NTR显着增加了荧光强度，在37°C时响应最强，表明影响荧光的是NTR激活，而不是温度。
我们还通过测试AF-1FNO2对不同NTR浓度的响应来检查AF-1FNO2的光热敏感性。随着NTR浓度从0增加到10μg/mL，AF-1F-NO2在780nm激光照射下在5分钟内以剂量依赖性方式从37.0°C加热到60.0°C。该波长与探针在770nm处的激活吸收峰相匹配，从而增强了光热转换。相比之下，在650nm照射下，AF-1FNO2表现出较大的温升，而NTR激活的AF-1F-NO2仅表现出小幅上升。值得注意的是，AF-1F-NO2和NTR的组合在20μM下使温度升高了27°C，这明显高于在780nm激光照射下单独使用AF-1FNO2观察到的5°C升高。这些结果凸显了NTR激活时光热效应的增强，证明了该探针在特定光热成像和PTT方面的潜力。AF-1F-NO2显示出优异的NTR选择性、强PA信号和高热功效，为精确缺氧激活PTT和使用双比例NIRF/PA成像体内实时治疗监测奠定了基础。
AF-1F-NO2探针通过比例荧光成像监测缺氧激活的PTT诱导的细胞死亡
受AF-1F-NO2探针通道2/通道1比率与缺氧（15%至1%）之间相关性的启发，我们通过实时量化缺氧来评估其监测PTT诱导的细胞死亡的能力。共聚焦显微镜和流式细胞术显示，在780nm激光照射下，PI和绿色通道（通道1）的荧光随着氧气的减少而增加，而Calcein-AM和红色通道（通道2）的荧光减少。1%O2下的通道2/通道1比率比常氧条件下低69倍，缺氧增加时细胞死亡量更高。该比率随着激光照射而降低，但在没有激光照射的情况下没有变化。在4T1细胞中，从21%O2到1%O2，观察到有和没有激光照射的比率之间存在很强的相关性(r=-0.998)。这些研究结果表明，AF-1F-NO2的比率荧光反映了缺氧细胞中的NTR水平和PTT，从而能够在体外实时监测PTT诱导的细胞死亡，并为体内诊断、治疗和疗效评估提供有价值的工具。
使用双比率NIRF和PA单分子治疗探针AF-1F-NO2对小鼠进行实时肿瘤诊断、治疗和定量评估。经过体外测试，我们评估了4T1荷瘤小鼠中AF-1F-NO2的缺氧反应双比率NIRF和PA成像，并与健康后肢进行比较。皮下注射后，肿瘤中的荧光(F850)和PA信号(PA770)在0至60分钟内增加，而F750和PA670信号减少。在健康的后肢中，荧光和PA信号显示出最小的变化。定量分析显示肿瘤组织中的F850/F750和PA770/PA670比率增加，在注射后60分钟达到峰值，而健康后肢没有明显变化。在4T1小鼠中观察到PA770/PA670和F850/F750之间存在很强的相关性(r=-0.985)。这些结果表明，AF-1F-NO2可以量化肿瘤中的NTR，并通过双比率NIRF/PA成像实时评估PTT疗效。NIRF和PA成像的比率信号可以相互交叉验证。体内研究表明，注射后2小时，AF-1F-NO2主要在肝脏中积累，并在5小时后代谢。解剖组织的离体NIRF成像证实了这一点，表明良好的生物相容性和实时体内PTT评估的适用性。我们在4T1荷瘤小鼠中评估了AF-1F-NO2的缺氧反应双比率NIRF和PA成像，并将其与健康后肢进行了比较。皮下注射AF-1F-NO2后，0~60min肿瘤内荧光（F850）和PA信号（PA770）逐渐增强，而荧光（F750）和PA信号（PA670）逐渐减弱。在健康的后肢中，这些信号保持稳定。定量分析表明，肿瘤中的F850/F750和PA770/PA670比率随着时间的推移而增加，在注射后60分钟达到峰值，而健康后肢没有显着变化。肿瘤中PA770/PA670与F850/F750比率之间存在很强的相关性(r=-0.985)。这些结果表明，AF-1F-NO2可以有效量化肿瘤中的NTR，并使用双比率NIRF/PA成像实时评估PTT疗效。体内研究表明，AF1F-NO2在注射后2小时内主要在肝脏中积累，并在5小时后由肝脏代谢，这通过离体NIRF成像得到证实。这表明AF-1F-NO2具有良好的生物相容性，可以安全地用于实时体内PTT评估。用AF-1F-NO2治疗的小鼠的光热效应导致肿瘤温度显着升高，从37.7°C升至59.2°C，而用盐水治疗的肿瘤显示出最小的温度升高。在PTT之前，测量了750和850nm处的肿瘤NIRF以及670和770nm处的PA信号，显示所有组的值相似。PTT后，肿瘤750nm处的NIRF变化最小，而850nm处的NIRF显着下降。F850/F750比率从1.4降至0.92，而PA770/PA670信号保持稳定。肿瘤比率NIRF/PA信号具有时间依赖性，随着时间的推移显着增加。肿瘤的3DMSOT图像显示，AF-1F-NO2+激光组中PA770/PA670比率随时间推移而降低，表明PTT后缺氧减少。相比之下，其他组的PA770/PA670比率有所增加，表明肿瘤中的氧分布不均匀。肿瘤生长曲线和组织学分析证实，与其他治疗相比，AF-1F-NO2+激光治疗显着抑制肿瘤生长。使用NIRF和PA比率成像定量测量PTT效果，显示F850/F750比率与肿瘤抑制率之间存在很强的相关性。治疗肿瘤的H&E染色显示AF-1F-NO2+NIR组中有更多坏死区域，证明AF-1F-NO2在抑制肿瘤生长方面的有效性，特别是在缺氧肿瘤中。未观察到明显的体重减轻或主要器官的病理变化，表明AF-1F-NO2对PTT的副作用较低。
结论
这项工作首次使用双比例NIRF/PA单分子治疗诊断探针实现了这些目标。我们通过测量PTT期间的NTR水平，证明了这些探针在肿瘤诊断、治疗和准确评估体内治疗效果方面的有效性。该方法结合了双比率NIRF/PA成像的优势，成功监测PTT缓解的肿瘤缺氧。
参考文献
Dual Ratiometric Single-Molecule Theranostic Probes for Photothermal Therapy and Real-Time Quantitative Evaluation of Therapeutic Efficacy In Vivo， Zhang, Shuping, Xingyue Liu, Bang-Ping Jiang, Shi-Chen Ji, Hua Chen, and Xing-Can Shen， Anal Chem,2025,97,(25): 13637–45， https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c02253.
