内容提要
我们通过在环辛炔的炔丙基位置安装一个碳酰胺连接的释放基团，开发了一种基于应变促进的炔烃-氮氧自由基环加成（SPANC）的点击释放化学方法，点击环加成后自发消除，从而实现有效负载的释放。在体外和细胞条件下均能保持卓越稳定性的前提下实现了药物的释放。我们还建立了一种简便的高活性氮氧自由基合成方法，从而构建了系统的底物库，并验证了该策略的广泛适用性。我们开发的生物正交抗癌前药利用氮氧自由基介导的激活来释放抗癌活性。在4T1小鼠乳腺癌模型中，这种生物正交前药激活策略显示出显著的肿瘤抑制作用和良好的安全性，证实了这种点击释放化学在体内应用的可行性。
结果与讨论
我们假设通过硝酮−环辛炔点击反应形成的N-烷基化异噁唑啉环加成物，能够通过丙炔基氨基甲酸酯部分介导的环加成后1,4-消除级联反应，最终实现有效载荷的释放。为了评估这一策略，我们合成了带有对硝基苯胺（p-NA）报告基团的环辛炔衍生物COT-p-NA，并使用苯基硝酮Ni-1作为脱笼触发剂。
为确认反应的特异性，我们评估了其他对照化合物（包括二乙基羟胺、叠氮化物、Tz以及强亲核试剂如谷胱甘肽（GSH）和二甲胺（DMA））启动丙炔基氨基甲酸酯官能化环辛炔连接体（COT-p-NA）负载释放的能力。值得注意的是，在37°C下将1毫摩尔的COT-p-NA与每种5毫摩尔的化合物在50%二甲基亚砜/磷酸盐缓冲液中孵育24小时后，未检测到p-NA。为了进一步评估丙炔基氨基甲酸酯基团对环加成区域选择性的影响，我们合成了对照化合物COT−OH，这是一种缺乏氨基甲酸酯功能的羟基取代结构类似物。在相同条件下，COT−OH与Ni-1发生了环加成反应，这一点通过1HNMR和LC-MS分析得以证实。定量积分显示，两种异构环加成产物的生成量近乎等摩尔。这一结果与氨基甲酸酯官能化的COT-p-NA所观察到的区域选择性形成了鲜明对比，表明氨基甲酸酯基团起到了关键的导向基团作用，引导初始环加成反应朝着释放活性构型进行。在对基于SPANC的点击释放系统进行验证之后，我们试图改进其反应动力学。当COT-p-NA（50μM）在20%DMSO/PBS中与Ni-1（500μM）在室温下反应1小时后，观察到的对硝基苯甲酸（p-NA）释放量极低（<1%），对应的二级反应速率常数(k2)低于0.1M−1s−1。鉴于SPANC反应的逆电子需求特性，我们认为Ni-1的低反应活性是由于缺乏α位的吸电子活化作用。为解决这一问题，我们在α位引入了一个羰基，得到了α-酮基硝酮Ni-2。在相同条件下，Ni-2的反应动力学有了显著改善：在室温下1小时内释放了超过80%的p-NA，在生理温度（37°C）下30分钟内释放量超过80%。这些结果突显了α-羰基活化在增强基于SPANC的点击释放反应活性方面的有效性，并为未来硝酮触发剂的设计提供了合理的指导原则。为了实现对释放动力学的精确实时监测，我们设计了COT-AMC这种荧光探针，其中通过碳酰胺连接基将香豆素衍生物（AMC）与环辛炔连接起来。COT-AMC在37°C下于5%DMSO/PBS中24小时内表现出极佳的稳定性，背景荧光增加可忽略不计，这证实了其自发解笼的几率极低。合成的硝酮库表现出广泛的官能团兼容性，所有衍生物均能有效触发COT-AMC中AMC的释放，这通过分光光度法测量的荧光恢复得到了证实。为了进一步验证这些发现，我们通过高效液相色谱法（HPLC）系统地分析了所有COT-AMC反应混合物。结果表明，每种α-羰基硝酮均能实现高负载释放效率，产率超过90%。在α-羰基芳基硝酮中，Ni-3（带有强吸电子取代基）表现出最快的脱笼动力学（k2=18.2±2.4M−1s−1）。有趣的是，Ni-8（α-萘羰基硝酮）的反应活性高于其他芳基变体（k2=22.1±4.4M−1s−1）。在萘基系列中，甲氧基的引入逐渐加快了脱笼动力学（Ni-9，k2=40.4±6.8M−1s−1；Ni-10，k2=69.4±12.2M−1s−1）。这种增强的反应活性与分子疏水性的增加相关，表明可能存在疏水效应。相反，Ni-11中的α-羰基叔丁基的位阻效应极大地降低了其点击反应活性（k2<0.1M−1s−1），尽管其载荷释放效率仍保持较高水平（91.0±0.9%）。与α-酮亚硝基相比，二苯基亚硝基Ni-12的反应活性相对较低，其释放效率为69.6±3.6%，处于中等水平。
通过在生物相关环境中评估其对COT-AMC的去笼效率，来考察Ni-2对亲核试剂的生物正交性。荧光测量显示，在含1毫摩尔半胱氨酸/丝氨酸/酪氨酸的PBS中进行反应与仅在PBS中进行反应相比，荧光强度没有显著降低。至关重要的是，在添加COT-AMC之前，将Ni-2与1毫摩尔半胱氨酸/丝氨酸/酪氨酸预孵育8小时，仅导致荧光强度略有下降。这些发现最终证明了Ni-2具有出色的生物正交性和与代表性氨基酸的极低交叉反应性，支持其适用于体内应用。鉴于硝酮作为缺电子反应物，需要足够的缺电子性以获得高反应活性，而这一特性可能会同时增加其对水解或生物硫醇亲核攻击的敏感性，我们系统地评估了合成的α-羰基硝酮的稳定性。为了评估在生物相关条件下的稳定性，将硝酮Ni-2、Ni-3和Ni-7（电子取代基效应不同）在5%DMSO/PBS中于37°C下分别与2mM谷胱甘肽（GSH）或2mM抗坏血酸钠一起孵育。24小时后，通过高效液相色谱（HPLC）分析测定残留化合物的水平。Ni-2和Ni-7表现出极高的稳定性（即使在高硫醇浓度下，降解率也低于15%）。相比之下，带有吸电子基团的Ni-3在亲核硫醇存在下稳定性显著降低，但孵育后仍保留63.4±5.3%的完整性。这些结果表明存在内在的权衡：增强缺电子性以加快逆电子需求反应动力学会不可避免地降低生物稳定性。为了探究我们的点击释放系统在活细胞中的生物正交适用性，我们在4T1乳腺癌细胞中进行了荧光成像实验。单独用COT-AMC（20μM）孵育2小时后未观察到荧光信号，这证实了其在细胞内的稳定性。为了评估硝酮在细胞内的性能，先用Ni-3（100μM）处理细胞，然后在处理后4、8、12和24小时分别加入COT-AMC（20μM），再孵育2小时。在所有情况下，均检测到强烈的蓝色荧光信号，这表明细胞内成功裂解了氨基甲酸酯键并释放了AMC。这些结果表明Ni-3在细胞环境中仍具有强大的脱笼活性，突显了其在体内生物正交应用中的潜力。此外，鉴于此前有报道称环辛炔可与生物硫醇发生反应，47我们研究了负载有效成分的COT衍生物在生物相关条件下的稳定性。将COT-AMC（50μM）在20%DMSO/PBS缓冲液中于37°C下与包括谷胱甘肽（GSH，3mM）、半胱氨酸（Cys，3mM）和二甲胺（3mM）在内的亲核物质一起孵育24小时。结果表明，在所有测试条件下，COT-AMC均未出现明显降解，表现出极佳的稳定性。为作对比，我们使用BCN-1（50μM）作为对照进行了相同的稳定性评估。孵育24小时后，仅在高浓度GSH存在的情况下观察到BCN-1有显著降解，剩余79.7±2.3%。LC-MS分析证实形成了主要的硫醇加成产物，这与先前文献报道一致。47这种差异稳定性可以从机理上加以解释：硫醇-炔烃反应被认为通过自由基途径进行，48而COT衍生物中存在丙炔基吸电子基团，这可能会使自由基中间体变得不稳定，从而提高活化能垒并且降低了硫醇的反应活性。这一特性使COT衍生物有别于传统的、张力更大的环辛炔（例如DIBO、DIBAC、BCN），后者更容易发生硫醇加成反应。
我们策略性地引入了环辛炔基团来掩蔽两种抗癌药物——阿霉素（Dox）和喜树碱（CPT）的药理活性，从而生成了相应的生物正交前药COT-Dox和COT-CPT。通过硝酮触发的药物释放的高效液相色谱分析表明，前药被迅速消耗，活性药物得以高效释放。值得注意的是，Ni-2和Ni-3均表现出较高的激活效率，每种有效载荷的释放率均超过80%（COT-Dox：分别为88.5±1.9%和89.7±1.5%；COT-CPT：分别为82.4±0.6%和86.7±1.3%）。带有给电子芳香族取代基的Ni-7表现出稍低但仍然可观的释放效率（COT-Dox：83.0±1.3%；COT-CPT：79.7±1.5%），证实了其能够有效触发药物释放。为了验证细胞环境中生物正交、按需药物激活的效果，我们评估了前药−硝酮组合的抗癌功效。两种前药的细胞毒性均显著低于其各自的母体药物（COT-DoxIC50=76.0±16.1μM；COT-CPTIC50=38.1±4.0μM），表明通过环辛炔笼掩蔽有效抑制了药物活性。在与硝酮（100μM）联合处理后，两种前药的细胞毒性恢复到与母体药物相当的水平，证实了通过点击释放机制实现了细胞内激活。关键的是，使用硝酮100μM（用于生物正交激活的浓度）处理并未对细胞活力造成可测量的损害。即使在更高浓度下，硝酮也表现出极低的细胞毒性，IC50值超过300μM，这与它们设计的生物正交性和生物惰性相一致。总之，这些发现表明硝酮能够在生物系统中选择性地解除环辛炔偶联的功能分子的掩蔽，为体内应用奠定了坚实的基础。
为了验证COT-Dox前药在肿瘤中的特异性激活，我们在4T1肿瘤荷瘤小鼠中进行了药代动力学（PK）研究。结果表明，在所有评估时间点，联合治疗（COT-Dox+Ni-7）在肿瘤中实现的阿霉素浓度与游离阿霉素组相当。具体而言，肿瘤中的浓度分别为：2小时，127.5±5.9纳克/克（游离阿霉素组为139.2±25.5纳克/克）；4小时，139.9±24.2纳克/克（游离阿霉素组为148.6±10.0纳克/克）；8小时，170.9±22.4纳克/克（游离阿霉素组为125.1±33.1纳克/克）；24小时，130.1±28.5纳克/克（游离阿霉素组为116.4±5.5纳克/克）。这些结果证实了前药在肿瘤组织中的高效且特异性的生物正交激活。重要的是，联合治疗组中阿霉素的脱靶蓄积显著减少。例如，给药后4小时心脏中的阿霉素水平为5.6±1.2纳克/克，显著低于游离阿霉素组的48.46±1.8纳克/克。同样，2小时和4小时肝脏中的阿霉素水平分别为257.1±72.5纳克/克和479.7±81.3纳克/克，而游离阿霉素组分别为2134.0±670.3纳克/克和2364±1040纳克/克。血浆中多柔比星浓度的相应降低也得到了观察，这表明前药系统的非特异性激活程度极低。为了进一步评估前药方法的可扩展性和安全性，我们给予高剂量的COT-Dox（13.8μmol/kg，静脉注射），并在给药后1小时进行瘤内注射Ni-7（34.5μmol/kg）。作为对照，对照组小鼠接受等量的游离多柔比星（13.8μmol/kg），这相当于最大耐受剂量。50药代动力学分析表明，与游离多柔比星组相比，前药方案维持了多柔比星在肿瘤中的有效特异性蓄积，同时显著降低了心脏和肝脏的暴露量。总之，这些数据进一步证实了我们生物正交前药系统的体内有效性和安全性，并突显了其通过实现更高剂量给药同时降低全身毒性来增强化疗效果的巨大潜力。此外，我们还设置了一个仅接受COT-Dox前药而不使用Ni-7触发剂的对照组。在该组中，未检测到任何多柔比星的生成水平，这证实了我们的点击释放机制在体内具有出色的生物正交性。这些结果共同证明了我们的点击释放系统在体内的有效性，其中通过硝酮介导，环辛炔笼式前药在肿瘤部位的活性得以成功激活。与直接向肿瘤内注射游离的阿霉素相比，Ni-7包裹的COT-Dox前药避免了对局部组织造成潜在损伤。51虽然本研究重点在于验证其潜在的生物正交裂解化学反应，但其他给药策略，例如已确立的“捕获与释放”生物聚合物方法，同样能够实现甚至进一步增强这种效果。26,34利用硝酮易于修饰且在生理条件下稳定的特性，未来的转化应用可能包括通过与肿瘤靶向载体（如抗体或纳米颗粒）偶联实现预靶向给药，或者将其纳入硝酮修饰的生物聚合物中以实现局部药物的持续释放。
结论
我们开发了一种基于SPANC的生物正交点击释放平台，其特点是反应动力学快、有效载荷释放效率高以及化学稳定性好。该系统的功效源于吸电子的氨基甲酸酯导向的区域选择性[3+2]环加成反应，随后自发的消除级联反应促进目标分子的释放。为解决高活性硝酮合成中的局限性，我们建立了一种简便的无金属方法，通过卤素取代和自发的有氧氧化来制备α-酮硝酮，从而构建了具有可调活性和释放特性的多样化硝酮库，突显了该平台的多功能性。最后，我们构建了几种生物正交前药，并通过细胞和小鼠模型的概念验证证实了硝酮激活的环辛炔笼分子在体内的可行性
参考文献
Development of Cyclooctyne-Nitrone Based Click Release Chemistry for Bioorthogonal Prodrug Activation both In Vitro and In Vivo, Xiaowei Xu,YuananWang,Yangfei Shi, Xin Wang,Xidan Tong,Yanzhao Chen,Yan Zhao,Jiaxuan Chen,Weiwei Guo, Yueqin Zheng， J. Am. Chem. Soc., 2025, 147，3442534437， DOI:10.1021/jacs.5c08152
