内容提要
本研究提出了一种创新的H2S气体增强型PDT策略，采用智能型BODIPY基光激活H2S释放有机光敏剂B3，通过整合"双刃剑"H2S与活性氧来攻克缺氧肿瘤治疗的复杂难题。由B3与Pluronic F127自组装形成的纳米治疗剂B3-PS&GD，在光照下可同步释放足量H2S和单线态氧（1O2）。H2S能有效抑制线粒体呼吸、下调缺氧诱导因子1α（HIF-1α）表达、增强肿瘤血管通透性，从而提升PDT疗效。B3-PS&GD能在不依赖氧气的条件下诱导肿瘤细胞发生强效光控免疫原性焦亡。作为光激活免疫纳米激动剂，B3-PS&GD可精准激活肿瘤区域ICD、启动强效抗肿瘤免疫应答，在4T1荷瘤小鼠模型中展现出卓越疗效。
结果与讨论
光活化硫化氢释放光敏剂的设计与光功能调控
我们假设光介导的硫化氢释放与活性氧产生可通过单一有机分子实现。为验证该假说，我们在光激活供体B1基础上，合成了硼甲基化BODIPY光笼衍生物B2，以及硼甲基化环共轭变体B3。B1-B3分子的紫外-可见吸收光谱与发射光谱相较于氟硼分子B1，硼甲基化衍生物B2的吸收与发射光谱呈现约30纳米蓝移，这归因于硼甲基基团吸电子能力的减弱，该现象与同类BODIPY衍生物的报道结果一致。相反，由于共轭体系的扩展，光笼分子B3在吸收和发射光谱上相比B2表现出约40纳米的红移。值得注意的是，光激活型硫化氢供体B1-B3的吸收和荧光发射光谱延伸至远红区（λabs：600-750纳米；λem：700-780纳米），其荧光量子产率分别达到0.66、0.52和0.45，分别显示出在生物医学应用领域的卓越潜力。
我们深入研究了光激活H2S供体B1-B3的光敏特性。采用商品化活性氧（ROS）指示剂DPBF进行评估：硼氟化BODIPY光笼B1在黑暗环境或660 nm激光（10 mW·cm−2）照射下均未产生ROS（DPBF水平无变化，；而B2和B3溶液则呈现DPBF吸收显著下降，表明有效ROS生成。通过每10秒监测418 nm处DPBF吸光度变化，以亚甲基蓝（MB，0.52）为参照，计算出B1-B3在水介质中的相对ROS量子产率分别为0.03、0.20和0.25。采用TEMP和BMPO作为自旋捕获剂分别检测II型ROS（单线态氧1O2）和I型ROS（羟基自由基·OH及超氧自由基O2−·）的电子顺磁共振（EPR）谱显示：B2和B3照射后产生氧化TEMP的特征信号，但未检测到BMPO信号，证实其优先产生II型ROS（1O2）。
光介导协同治疗剂的制备与表征
为提升化合物B3在生物医学应用中的效用与生物相容性，研究人员采用Pluronic F127对B3进行包裹，形成兼具光敏剂和硫化氢供体功能的纳米颗粒B3-PS&GD。作为对照光敏剂，本研究合成了中位缺失TCM取代基的硼甲基化BODIPY衍生物B0。B0产生的单线态氧量与B3相当。展示了B0的紫外-可见吸收光谱与发射光谱。为探究硫化氢与活性氧的协同作用，研究人员分别通过B0或B1与Pluronic F127的自组装制备了光敏剂纳米颗粒B0-PS和硫化氢供体纳米颗粒B1-GD。动态光散射（DLS）表征显示，B0-PS、B1-GD和B3-PS&GD在水溶液中均匀分散，其流体力学平均直径分别约为167纳米、145纳米和131纳米。该尺寸范围非常有利于通过增强渗透滞留（EPR）效应实现被动肿瘤靶向。透射电子显微镜（TEM）图像进一步证实了这些纳米颗粒的均一球形形态。随后使用H2S选择性荧光探针WSP-5[21]研究了可光活化H2S供体向4T1细胞释放H2S的过程。经B1-GD+L和B3-PS&GD+L处理的4T1细胞显示出显著增强的绿色荧光信号，这表明BODIPY光笼衍生物B1和B3在远红光LED照射下（630-690 nm，0.5 W⋅cm−2）成功高效地发生光解，随后CA在体外生成H2S。与之形成鲜明对比的是，无论光照或黑暗条件，经B0-PS处理的4T1细胞显示的H2S水平与未处理对照组相似，这归因于其缺乏B0组内的H2S供体。对各组多幅图像的细胞内平均荧光强度进行量化分析。B3-PS&GD + L组的荧光强度约为B1-GD + L组的两倍，且显著高于其他处理组。B1-GD、B0-PS和B3-PS&GD的LED光处理组均表现出不同程度的线粒体膜电位紊乱，具体表现为JC-1聚合物（红色荧光）向单体（绿色荧光）的转变。在B1-GD+L和B0-PS+L组中，绿色荧光的增强表明H₂S或¹O₂对线粒体功能造成了显著损害。值得关注的是，B3-PS&GD+L组中这种效应最为显著，凸显了光介导的活性氧（ROS）与H₂S之间的协同作用。随后通过ATP检测试剂盒评估细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平，ATP水平的变化趋势与线粒体损伤程度高度相关。经B3-PS&GD+L处理的细胞ATP水平降至PBS培养细胞的60%左右，证实了¹O₂与H₂S对线粒体呼吸的有效协同抑制作用。采用氧指示剂Ru(dpp)₃Cl₂检测4T1细胞的氧水平，该指示剂在O₂存在时荧光信号会淬灭。在NaHS和B1-GD+L处理组中，氧指示剂的红色荧光信号较对照组减弱，表明H₂S处理的4T1细胞氧水平升高，这可能是由于细胞呼吸和氧耗量受到抑制所致。升高的氧水平有望增强氧依赖性PDT的疗效。经B3-PS&GD+L处理后，氧指示剂的红色荧光信号进一步增强，这归因于PDT介导的氧耗量。同时通过定量HIF-1α表达水平评估不同处理组的细胞缺氧程度，结果显示经NaHS、B1-GD+L和B3-PS&GD+L等H₂S处理的细胞中HIF-1α表达下调，证实了H₂S对肿瘤缺氧微环境的调控潜力。
通过采用活性氧探针二氯二氢荧光素二乙酰酯（DCFH-DA）进行荧光成像，验证了细胞内光敏性。仅在经B0-PS和B3-PS&GD预处理并接受光照的4T1细胞中，检测到二氯荧光素（DCF）的特异性绿色荧光信号，这表明单线态氧（1O2）的有效生成。与PBS组相比，B0-PS+L组中DCF荧光信号强度提升了5.6倍，B3-PS&GD+L组则达到7.9倍增幅。B3-PS&GD+L组观测到显著更高的单线态氧荧光强度，表明硫化氢通过调控细胞生理活动对光动力疗法产生了增强效应。我们采用甲基噻唑基四唑（MTT）法评估了B3-PS&GD在常氧与缺氧条件下的细胞内细胞毒性。经照射后，B1-GD处理组细胞仅因H2S对线粒体的特异性作用产生轻微损伤。相比之下，B0-PS+L和B3-PS&GD+L处理组以剂量依赖性方式显著抑制4T1细胞增殖。B0-PS在常氧条件下表现出显著的光细胞毒性，表明其具有强效光动力性能，而在缺氧条件下其光细胞毒性明显减弱。当活性氧（ROS）与H2S协同作用时，B3-PS&GD组细胞存活率显著下降。值得注意的是，B3-PS&GD在缺氧条件下仍保持高效力，且相较于B0-PS展现出更显著的光细胞毒效应。这些结果表明B3-PS&GD+L组通过抑制细胞呼吸作用有效缓解细胞缺氧，从而为高效PDT保存氧气，即使在缺氧条件下亦然。此外，钙黄绿素-AM/PI共染色实验显示B3-PS&GD+L处理后死亡细胞（红色染色）占主导，进一步证实了B3-PS&GD的抗肿瘤功效。这些结果阐明B3-PS&GD在光照条件下能通过H2S与单线态氧（1O2）独特的光介导协同效应有效杀灭癌细胞，为攻克II型光动力疗法这一"阿喀琉斯之踵"提供了新思路。
B3-PS&GD诱导的体外细胞焦亡评估
受H2S与1O2在清除4T1细胞中展现出协同效应的启发，我们进一步探究了B3-PS&GD诱导癌细胞死亡的机制。值得注意的是，经B0-PS+L和B3-PS&GD+L处理的4T1细胞表现出肿胀、变圆、膜破裂及起泡等形态学变化（红色箭头所示），这些特征均指向细胞焦亡的发生。相比之下，此类形态学改变在对照组和黑暗组中均未观察到这些现象。为深入阐明细胞焦亡过程，我们采用了caspase-1抑制剂VX-765。抑制caspase-1引发了显著的形态学变化，由此证实了caspase-1相关细胞焦亡的参与。为阐明活性氧簇（ROS）诱导细胞焦亡的分子机制，我们采用蛋白质免疫印迹技术（WB）对不同处理组细胞中焦亡相关生物标志物进行分析。经B0-PS和B3-PS&GD处理并接受光照的4T1细胞中，剪切型caspase-1表达显著上调。虽然所有实验组均检测到全长gasdermin D（GSDMD）蛋白，但N端剪切形式GSDMD-N的增多主要出现在B0-PS+L和B3-PS&GD+L组，这表明光动力治疗（PDT）激活了GSDMD介导的焦亡通路。此外，在焦亡过程中还检测到损伤相关分子模式（DAMPs）如乳酸脱氢酶（LDH），以及促炎因子白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）的释放，该现象归因于质膜上GSDMD孔道的形成促进了这些物质向肿瘤微环境（TME）的释放，其作用通路如图5f所示。研究结果表明，B0-PS和B3-PS&GD在光照条件下诱导ROS产生，进而激活细胞膜上的caspase-1，导致GSDMD剪切为GSDMD-N功能域。相比之下，B1-GD处理组未呈现显著焦亡现象。但与B0-PS+L处理的4T1细胞相比，B3-PS&GD+L组表现出更高水平的剪切型caspase-1和GSDMD-N表达，同时伴随IL-1β、IL-18及LDH释放量的增加。这些发现证实硫化氢（H₂S）能够增强ROS生成并放大PDT诱导的焦亡效应，从而凸显B3-PS&GD在促进抗肿瘤免疫方面的潜在价值。
B3-PS&GD的体内抗肿瘤性能
我们通过进一步研究评估了所制备纳米粒子的生物分布和肿瘤滞留特性。在4T1荷瘤BALB/c小鼠模型中，使用活体成像系统追踪了静脉注射B1-GD、B0-PS和B3-PS&GD后（0、3、6、12和24小时）B0、B1和B3的荧光信号。三种纳米粒子在肿瘤部位的荧光信号自给药3小时后逐渐增强，6小时达到峰值，24小时显著减弱。此外，在注射后6小时和24小时获取主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏）及肿瘤组织进行离体成像。离体荧光成像结果显示，B1-GD、B0-PS和B3-PS&GD在注射6小时后主要富集于肿瘤和肝脏，并在静脉注射24小时后有效从循环系统清除。这些结果表明，三种纳米粒子具有优异的肿瘤蓄积能力，有望作为肿瘤显像的荧光示踪剂。基于活性氧（ROS）与硫化氢（H2S）光介导协同治疗及体外焦亡激活的显著效果，我们建立了4T1荷瘤小鼠模型以评估体内协同治疗效果。实验小鼠随机分为九组：1)PBS对照组、2)光照组、3)NaHS组、4)B1-GD组、5)B1-GD+L组、6)B0-PS组、7)B0-PS+L组、8)B3-PS&GD组、9)B3-PS&GD+L组（"＋L"表示使用红色LED光源照射，λmax=660nm，0.5W/cm2）。详细展示了给药时间轴和治疗流程示意图。治疗期间各组小鼠体重保持稳定，表明纳米材料具有良好的生物相容性。B0-PS+L和B3-PS&GD+L治疗组的肿瘤生长抑制效果显著优于其他实验组。值得注意的是，B3-PS&GD+L组小鼠在14天内表现出显著的肿瘤消退现象，这可能是H2S与ROS协同作用的结果（各组个体肿瘤生长曲线）。治疗14天后处死所有小鼠，摘取肿瘤进行影像记录、称重及病理学检查。体内实验数据显示，B3-PS&GD的抗肿瘤效果显著优于NaHS、B0-PS和B1-GD。以PBS组为基准计算，B3-PS&GD+L和B0-PS+L组的肿瘤抑制率分别为99.43%和85.15%。
结论
我们成功设计并合成了一系列新型光笼BODIPY分子，标记为B1-B3。通过通过对分子结构的精确调控，我们成功实现了光解效率和单线态氧量子产率的优化，并筛选出性能优异的B3分子作为智能光激活型硫化氢供体光敏剂，用于后续抗肿瘤治疗。本研究首次创新性提出"双剑合璧"策略，将光介导硫化氢气体疗法（GT）与光动力疗法（PDT）功能整合于单一有机光功能分子。在远红光LED照射下，由B3与F127组成的B3-PS&GD体系可实现硫化氢的时空可控释放，通过抑制细胞呼吸、下调HIF-1α蛋白表达及增强血管通透性，实现对缺氧肿瘤微环境（TME）的重编程。
参考文献
A photoactivatable H2S-releasing photosensitizer: Alleviating hypoxia and evoking pyroptosis for gas-augmented photodynamic and immune therapy，Meihui Su , Dongjie Li, Debin Kong, Luyi Zhang, Yunfeng Zhou , Hongyu Liu , Yunjian Yu , Hui Gao *,Chem. Eng. J, 524 (2025) 169638.， https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.169638
