内容提要
本工作介绍一系列基于4-硝基联苯衍生物的细胞器靶向、双光子可光激活荧光团(PAF)，用于线粒体、内质网和溶酶体靶向。这些PAF在单光子和双光子激发下都表现出高的亮度和光稳定性。通过将细胞器靶向基序与PAF偶联来实现细胞器特异性，具有低细胞毒性、良好的膜通透性和不同细胞中细胞器的特异性定位。在体外这些PAF通过双光子激发实现了小鼠肝脏、肾脏和心脏的深度组织成像(高达100μm)，在体内它们支持以最低背景对皮下肿瘤进行高分辨率的三维结构成像。
结果与讨论
本研究中使用的4-硝基联苯光笼是在我们先前工作的基础上开发的。在4-硝基联苯光笼中引入了细胞器靶向基团，包括内质网的苯磺酰胺、溶酶体的吗啉环和线粒体靶向的三苯基膦。这产生了三个细胞器特异性PAF(PhoRh-Mito，PhoRher，PhoRh-lyso)和一个非靶向PAF(PhoRh)。所有PAF都显示出一致的光物理行为。在水溶液中(1μM在10 0 mM磷酸二氢钠缓冲液中，pH 7.4)，PhRh在564 nm处有一个很强的吸收带，在笼状态(Φf≈0.017)有最小的荧光。在405 nm处的光激活裂解了4-硝基联苯的光笼，破坏了PET猝灭并恢复了罗丹明的荧光，导致吸收发生14 nm的蓝移，荧光打开(Φf=0.69)，在180 S范围内荧光增加了11.8倍。高效液相色谱法证实＞98%的转化率为罗丹明B，电喷雾质谱(ESI-MS)验证了降解产物(m/z为443.61)。笼状基团(370−410 nm)和荧光团(530−580 nm)的不重叠吸收带允许选择性激活(λex＞540 nm)。靶向PAF表现出相似的吸收/发射曲线和显著的荧光增强，证实了广泛的适用性。双光子去离子在740到840 nm之间进行了优化，在800 nm处获得了9.5%的效率。
我们评估了三种器官靶向PAF在活细胞成像中的应用。用四甲基偶氮唑盐比色法检测10μM作用24 h后细胞存活率为95%。共聚焦显微镜显示细胞快速摄取，在局部405 nm单光子照射后3分钟内有强烈的红色荧光，证实了有效的通透性和强大的光激活。ER-Tracker Green、MitoTracker Green和LysoTracker Green的共定位研究显示，在HeLa细胞中PAF的光激活后，靶细胞器中有强烈的红色荧光。初始皮尔逊相关系数分别为0.94(PhoRh-Mito)、0.94(PhoRh-ER)和0.96(PhoRh-lyso)。行扫描强度图证实了细胞器标记的亚细胞共存。激活后共定位稳定性在不同的PAF之间存在差异。PhoRh-MITO在30min内保持了较强的共定位(R~0.95)，而PhoRh-ER表现出中等的稳定性(10min时R=0.89，30min时降至0.86)。PhoRh-lyso呈渐进性解离，共定位在30min内由0.94降至0.80，并伴有胞浆扩散。这种行为归因于阳离子罗丹明与细胞器微环境之间的静电相互作用。线粒体和内质网分别通过负膜电位和阴离子磷脂保留荧光团。酸性溶酶体腔(pH 4.5−5.0)排斥阳离子荧光团。细胞器属性(pH、膜电位和脂类成分)控制着激活后的保留，强调了定制荧光团设计的必要性。这一趋势在不同类型的细胞中是一致的，在MCF-7细胞中得到证实。
我们研究了在飞秒激光照射下，活细胞中PhoRh PAF的双光子激活特性。用PhoRh-ER、PhoRh-lyso或PhoRh-Mito标记的细胞在800 nm双光子照射后显示出强烈的红色荧光，证实了它们对细胞器特异性成像的有效性。值得注意的是，选择性单细胞标记是通过定向双光子照射实现的，荧光激活仅限于单独照射的细胞。这使得能够在单细胞分辨率下进行时空控制的标记，有助于跟踪不同种群中的动态相互作用，同时最大限度地减少目标外信号。通过连续双光子激光激活和激发来评价PhoRhs的光稳定性。在1060 nm双光子激发下进行300次扫描后，荧光信号几乎保持不变，降至初始值的80%。PhoRh-Mito的荧光强度逐渐减弱，但在800 nm处光激活30分钟后仍可分辨，验证了其适用于长期细胞跟踪。PHRH工作在近红外窗口(800−1064 nm)，激发波长(800 Nm)和发射波长优化为组织深度穿透和最小的自发荧光。
鉴于PhoRh在细胞水平上的出色性能，我们对活组织的染色进行了进一步的研究。与培养的活细胞的显微镜不同，细胞器的原位成像，如完整组织中的线粒体，提供了更自然和准确的信息。肾脏和肝脏以其高代谢活性和丰富的线粒体而闻名，而肌肉组织中也含有丰富的这些细胞器。在随后的生物学研究中，我们使用奥林巴斯FVMPE RS双光子显微镜，在800 nm的飞秒激光激活和1060 nm的激发下，评估了PhoRh-Mito在小鼠肾组织、肝组织和心肌中对线粒体的光激活成像能力。用5μMPhoRh-MITO处理1h的小鼠组织，评价成像动力学和双光子性能。延时双光子共聚焦显微镜显示线粒体网络在2分钟内逐渐变亮，证实了高质量的成像。为了进一步验证PhoRh-Mito的深红发射和双光子吸收的优势，分析了小鼠肾脏、肝脏和心肌组织切片的荧光图像。与单光子共焦Z扫描成像(10μm穿透)相比，双光子Z扫描成像在深红色和近红外区域具有更长的激活和激发波长，从而实现了高达100μm的穿透。
为了评估PhoRh-Mito的体内成像性能，将该探针通过肿瘤内注射的方式注射到荷有皮下肿瘤的小鼠模型中，并通过双光子荧光显微镜进行成像。顶视图显示了组织的横向结构组织；侧视图确认了沿z轴的连续光学切片，并保持了轴向连续性；正交层切面映射了0−160μm的形态变化；高倍率视图显示了细胞边界、细胞间界面和微血管。对PhRh-Mito标记的解剖组织(包括肝脏、肾脏、心脏和肿瘤)进行了比较的体外成像，证实了PhoRh-Mito在单光子和双光子激发下都能被有效激活，发出明显的红色荧光。组织特异性结构的高分辨率细节被清晰地勾勒出来：例如，心肌细胞显示其特征的杆状形态，排列有序，而肝组织显示由多边形肝细胞组成的清晰的肝小叶。这些观察验证了该探针在不同组织类型中保持了激活效率和成像分辨率，增强了其在研究复杂生物背景下的细胞器动力学方面的广泛应用潜力。比较还表明，有效成像深度受注射途径(注射深度比组织浸泡浅)的影响，而不是固有的探头限制。值得注意的是，在相同的视野下，双光子显微镜在空间分辨率上优于单光子显微镜，能够分辨精细的细胞形态和微血管结构，从而实现高保真的组织可视化。
结论
细胞器靶向、双光子激活的PAF的发展代表了活细胞和组织成像领域的重大进步。据我们所知，这项研究是第一批细胞器靶向的双光子PAF之一。它们精确的时空激活使它们非常适合于超分辨率显微镜(例如Palm)，利用可光激活的开关进行纳米级亚细胞器成像。它们还有望用于双笼分析物识别探针，从而能够对特定检测的光活化和靶标结合进行正交控制。此外，它们的稳定性支持跟踪动态过程(例如，细胞器相互作用)，并且当与治疗药物共包裹时，它们可以报告局部药物释放。
参考文献
Two-Photon Light-Activatable Fluorophores for Organelle Imaging in Living Cellsand Tissue-Level Imaging.Zhuang Ma,Zhangcheng Fu,Boxuan Hou,Xueying Zeng,Junqiao Wang,Ying Tan,Yuyang Jiang,Naihan Xu,and Chunyan Tan.J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 37005−37011，https://doi.org/10.1021/jacs.5c14442
