内容提要
本研究通过多尺度化学调制策略提出了一种近红外(NIR)比例荧光/光声双模探针TPcy。六元环中心菁氨酸骨架与N-亚硝基化响应位点协同设计，实现了由NO响应驱动的显著光谱信号红移，磺酸侧链的引入带来了生物相容性和响应率的双重增强。靶向单元马来酰亚胺介导的蛋白共价偶联在不干扰探针功能的情况下实现了肿瘤的原位锚定和微环境富集。TPcy能够通过时空分辨双峰成像动态跟踪免疫治疗触发的M2到M1巨噬细胞复极化，揭示免疫激活与治疗结果之间的相关性。
结果与讨论
TPcy的合理设计
我们开发了一个基于N-亚硝化反应的比例NO传感平台，以调节苯酚酯染料主链上的电子推拉策略。以不同结构的酞菁染料(pys)为原料，与甲胺进行取代反应，得到相应系列的探针。在这里，具有大共轭体系的探针中的叔胺充当电子供体，而探针与NO反应形成的n-亚硝基具有很强的吸电子能力。因此，在甲胺向吸电子的n-亚硝基中提供电子的过程中，由于抑制了主链的分子内电荷转移效应(ICT)，探针的吸收和荧光发射波长发生了红移。探针Pcy1和Pcy2具有不同的环烯烃偶联中心，探针Pcy1的产率更高，这是由于在胺的亲核取代反应中，五元环碳正离子具有更大的稳定性。进一步，为了克服间苯三酚染料水溶性差和易聚集的影响，制备了探针Pcy-3通过在Pcy2的吲哚部分上引入两个磺化丙基链，这是一种设计策略，使探针具有良好的水溶性，以促进其在生物中的吸收。除此之外，我们还应该关注探针如何在生物医学上与目标位点结合。为了实现这一目标，我们开发了具有蛋白质结合能力的NO双峰响应率测定探针TPcy。通过Michael加成反应，马酰亚胺片段可以特异性地与暴露在蛋白质上的半胱氨酸残基(巯基，SH)发生反应，从而使TPcy能够很好地锚定在蛋白质上，促进肿瘤穿透和探针的富集。首先在10 mM PBS缓冲液(pH = 7.4, 50%乙醇)中研究探针与NO反应的光谱特性，结果总结表中。Pcy-1、Pcy-2、Pcy3和TPcy的最大吸收/发射波长分别为646/760 nm、620/762nm、622/766 nm和652/764 nm。而对应产物nPcy1、nPcy2、nPcy-3和nTPcy的最大吸收/发射波长分别位于818/838 nm、790/812 nm、798/818 nm和802/824 nm。与NO反应后，所有探针都表现出吸收和发射峰的红移。根据反应产物的吸收/发射峰强度与探针的强度之比，我们发现Pcy-2与NO的反应效率远高于Pcy-1，引入磺化丙基链的策略进一步增强了Pcy3对NO的响应效果。
双模比例探针TPcy的光学特性
我们将继续研究通过多尺度分子工程协同调制合理开发的探针TPcy的光谱特性。探针TPcy是通过马来酰亚胺衍生物(e)与水溶性菁染料(c3)的取代反应合成的。靶探针TPcy的设计理念以及NO传感原理和蛋白质结合策略如图所示。接下来，我们选择含有游离半胱氨酸残基的BSA作为靶蛋白，通过凝胶电泳验证TPcy的结合能力。结果表明，TPcy与BSA孵育后的蛋白带在BSA分子量为66.5 kDa左右显示出明亮的FL信号，证明TPcy与BSA共价结合形成的复合物可以通过TPcy的NIR-FL指示。同时，与BSA孵育的对照探针Pcy-3和与巯基被阻断的BSA孵育的TPcy两组蛋白带中均观察到可忽略的FL信号，说明TPcy与BSA的结合是通过马来酰亚胺与巯基的共价反应发生的组。值得注意的是，即使在GSH的干扰下，TPcy也能与BSA共价偶联。在NO存在的情况下，TPcy的时间相关光谱显示，探针在大约240 s时达到响应平衡，这表明TPcy对NO的响应非常迅速。与TPcy的检测性质相似，NO浓度在0 ~ 40 μM范围内变化，TPcy在652nm处的吸收强度逐渐减弱，而在802nm处的吸收强度增加(S32)。吸收强度比(A802/A652)的对数与NO浓度呈良好的线性关系，根据公式3σ/k (σ为空白样品读数的标准差，k为拟合线的斜率)计算出NO的TPcy检出限(LOD)为0.26 μM。同样，TPcy对NO的FL响应表现为比例检测性质，根据线性拟合计算出FL检测的LOD为0.19 μMTPcy的荧光强度比(I824/I764)与NO浓度之间的曲线。上述吸收和FL测试结果表明，TPcy对NO的比例响应具有足够的检测灵敏度。以Cy5和ICG为参考，TPcy的荧光量子产率(φ)分别为7.44%和0.86%。其反应产物nTPcy对应的ϕ值分别为0.31%和5.95%。这两种不同荧光通道之间的显著差异是至关重要的，因为它直接使强比率信号的产生成为探针检测原理的核心。为了验证TPcy检测NO的特异性，分别测试了TPcy与金属离子、阴离子和活性物质反应后的吸收光谱和FL光谱。吸收/FL强度比仅在NO存在时才有显著变化，而其他反应物质引起的变化可以忽略不计，证明TPcy对NO具有高选择性。而在肿瘤微环境的弱酸性pH范围内，TPcy本身以及对NO的反应均表现出较高的稳定性，提示TPcy检测肿瘤环境中NO的可能性。此外，TPcy对NO的响应具有良好的稳定性。通过模拟体外肿瘤弱酸性微环境和培养液中肿瘤微环境，分别检测TPcy响应NO前后的FL信号。从图的结果可以看出，TPcy和反应产物nTPcy在弱酸性环境和降解较少的培养基中都能保持荧光信号稳定8小时。重要的是，它们的比例FL强度在这段时间内没有明显变化，保证了实时成像信号的稳定性。综上所述，TPcy对NO的响应具有高效、高灵敏度和高选择性的优点。
免疫药物诱导M2到M1复极化的细胞荧光成像
为了研究巨噬细胞复极化过程中TPcy对NO的荧光成像，我们以RAW264.7细胞为研究对象。首先，我们分别使用脂多糖(LPS)或IL-4和IL-13共同诱导RAW2647细胞分化为M1或M2表型。流式细胞术分析显示，诱导的M1巨噬细胞CD86高表达，M2巨噬细胞CD206高表达。ELISA分析显示，M1巨噬细胞分泌细胞因子白细胞介素-12 (IL-12)， M2巨噬细胞分泌白细胞介素-10 (IL-10)。通过NO商业探针(DAF-FA DA)对细胞进行FL成像，我们发现M1巨噬细胞中的NO表达高于M2。相关生物标志物的鉴定表明，我们成功地诱导RAW264.7细胞分化为M1和M2表型。接下来，我们研究了M2巨噬细胞的复极化过程与细胞内NO水平的关系。使用不同浓度的R848诱导RAW264.7细胞从M2表型向M1表型再极化。ELISA和流式细胞术结果显示，M1标记物(IL-12、CD86)表达升高，M2标记物(IL-10、CD206)表达降低。并且这些趋势与免疫药物浓度之间存在剂量依赖关系。R848处理后，巨噬细胞比值(M1/M2)随着R848浓度的增加而增加，并在R848浓度为100 nM时达到峰值。此外，细胞内NO FL成像结果证实了复极化期间细胞内NO水平与R848药物浓度(0-100 nM)呈正相关趋势。这些结果表明，R848可以有效地驱动M2向M1表型的再极化，这一过程中伴随着NO的产生，因此NO可以作为研究再极化过程的重要生物标志物。为了研究所开发的探针是否适用于活细胞成像，我们首先通过细胞计数试剂盒8 (CCK8)试验评估了TPcy的细胞毒性。不同浓度的TPcy孵生24 h后，M1型和M2型巨噬细胞的细胞存活率均可达到80%以上，表明探针TPcy具有生物相容性。分别利用TPcy在细胞成像中的浓度和时间条件，与M1和M2巨噬细胞共孵育后进行流式细胞术分析。结果显示，M1/M2比值几乎恒定，不受TPcy的影响，说明TPcy不干扰巨噬细胞极化动力学。接下来，用不同剂量的R848诱导M2巨噬细胞重极化，并加入TPcy进行细胞FL成像，其中红色通道代表TPcy，品红通道代表TPcy对NO产生反应后的产物，品红通道与红色通道FL强度之比代表NO水平。未添加药物的M2巨噬细胞中红色FL信号明显，洋红色FL信号可忽略。不同剂量R848(20、50、100 nM)作用24 h后，细胞内洋红色FL信号逐渐增强。定量分析结果显示，M2巨噬细胞中NO水平与R848剂量(0-100 nM)呈正相关趋势。M1极化的特征是诱导iNOS的表达，而NG-monomethyl-L-arginine(L-NMMA)是iNOS的抑制剂，可以作为有效的阴性对照。与对照组相比，先用R848诱导M2巨噬细胞重极化上调内源性NO水平，然后用探针TPcy染色，比例FL强度增加。然而，当r848诱导的M2巨噬细胞用iNOS抑制剂LNMMA下调NO水平时，TPcy的比值FL强度显著降低。而DAF-FM DA染色结果也出现了同样的变化。TPcy可以高度敏感地跟踪免疫复极化过程中内源性NO水平的变化。此外，还使用探针Pcy-3作为对照，对r848诱导的复极化过程进行了细胞荧光成像。Pcy3的比值FL强度随R848剂量的增加呈上升趋势，但与TPcy相比，Pcy-3的FL强度和比值信号较弱，证实了细胞水平上耦合设计的优越性。
体内双模成像评价TPcy的肿瘤靶向
成像前分别将Pcy3或TPcy静脉注射到BALB/c小鼠体内，注射24 h后器官组织切片未见明显损伤，说明Pcy-3和TPcy具有良好的生物安全性。白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，白蛋白偶联探针用于医学成像的策略已在临床实践中得到应用。它们出色的肿瘤定位能力归功于两个因素:一是肿瘤内血管和淋巴异常缺陷引发的通透性和滞留性(EPR)效应增强;二是白蛋白结合受体在多种肿瘤中的高表达，如分泌蛋白酸性和富含半胱氨酸(SPARC)的。在4T1荷瘤小鼠体内注射Pcy-3或TPcy后，通过双模成像评估TPcy的肿瘤定位能力。基于探针本身的近红外吸收和FL特性，可见TPcy注射后，在体内FL和PA图像中，肿瘤区域有清晰的光信号，而注射对照探针Pcy3后，肿瘤区域的光信号明显减弱。这些现象表明偶联探针TPcy可以通过与白蛋白半胱氨酸残基的共价结合实现蛋白锚定，从而大大降低染料的ACQ效应，提高生物利用度。两组小鼠离体器官的FL成像结果进一步观察到一致的现象。我们进一步研究了TPcy在体内的荧光动力学。与肿瘤相比，TPcy在其他主要器官中的荧光信号衰减迅速，肿瘤中TPcy的半衰期(179.5s±2.12)远高于肝脏(75.35 s±1.91)和肾脏(60.75 s±1.34)(表S4)。这为通过白蛋白偶联增强肿瘤特异性富集的探针设计策略提供了强有力的证据。此外，TPcy在主要器官中的快速代谢使其表现出理想的药代动力学特性，从而证实了TPcy良好的生物安全性。影像学结果显示TPcy具有良好的肿瘤富集和保留作用，因此我们通过TPcy的双峰信号指示进一步研究荷瘤小鼠免疫治疗过程中M2向M1巨噬细胞的复极化。
结论
本研究提出了一种共价蛋白偶联和NO触发的近红外比例FL/PA双模探针(TPcy)，用于肿瘤免疫治疗过程中巨噬细胞再极化的实时监测。其化学设计策略通过多层协同优化解决了靶向性、信号可靠性和体内相容性方面的挑战。(1)电子调制和传感模块构建:基于菁氨酸骨架的n亚硝化反应驱动电子推拉系统通过六元环中心稳定电子扰动，触发抗干扰的FL/PA光谱红移，显著增强了动力学和比值信号。(2)分子界面工程:引入亲水磺酸基链，优化响应速率，同时促进生物应用。(3)共价靶向和协同生物递送:利用马来酰亚胺对白蛋白半胱氨酸残基进行共价偶联，实现探针在肿瘤中的高效富集，突破成像探针定位精度的限制。因此，通过上述化学策略的协同作用，TPcy实现了对NO动力学的高灵敏度、选择性和时空分辨检测。
参考文献
Multiscale molecular engineering co-modulated dual-mode ratiometricprobe for monitoring tumor-associated macrophage repolarization，Xinyue Li, Ning Li, Zhiang Duan , Xuan Zhang, Baodui Wang ，Biomaterials，2026, 326, 123686， https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2025.123686
