内容提要
本项目合成了六种半花菁衍生物，它们的发射波长延伸至短波红外区域，且其结构便于构建激活型探针。这些染料的红移是由中央多甲川桥的延长以及呫吨内环氧原子被较重的硫原子取代所驱动的。在所有荧光团中，具有三个中央甲川-甲川键的HCS6的最大发射波长最长，达到1010纳米，同时还具备优异的光稳定性和较高的短波红外亮度。这些特性使HCS6能够在无需剃毛的情况下对有毛小鼠模型进行肺部成像。此外，HCS6被构建成一种激活型探针，它能响应癌症相关生物标志物，选择性地开启其短波红外荧光，从而能够高灵敏度地识别未剃毛小鼠的转移性肺部病变。
结果与讨论
染料的合成和光物理性质研究
半花菁系列（HCO2⁻6、HCS2⁻6）是采用吲哚氧杂蒽醛Knoevenagel缩合路线合成的，因为醛前体适合通过Wittig反应进行次甲基延伸。先前的研究表明，每一次用于一个次甲基-次甲基桥延伸的Wittig反应至少需要两个步骤，这导致总产率较低。在我们的研究中，由2-溴-1-环己烯-1-甲醛1合成的氧杂蒽醛2，直接与缩醛叶立德4反应，得到醛端基的3，其可通过一步简化工艺进一步延伸为4，且产率显著提高。通过克诺文格尔缩合反应，在乙酸酐中使用化合物2-4与吲哚翁合成了一系列荧光团。这些化合物分别被命名为HCX2、4、6，其中数字后缀反映了吲哚鎓受体和呫吨供体之间的次甲基碳数量，“X”表示呫吨杂原子O或S。通过碘化取代反应，在三甲基-3H-吲哚-1-鎓的氮原子上引入了一个可点击的叠氮基，从而能够利用铜催化的叠氮-炔烃环加成点击化学轻松地与聚乙二醇（PEGs）等官能团偶联。在代表性溶剂中，对六种半花菁的光物理性质进行了测量，并与HCO2的光物理性质进行了比较。在二氯甲烷（DCM）中测得的HCO4、6以及HCS2、4、6的最大吸收波长分别为775、871、718、827和924纳米，与HCO2（668纳米）相比，各自的红移分别约为107、203、50、159和256纳米。较长的HCO6和HCS6由于佩尔斯畸变表现出显著更宽的吸收。此外，HCO4、6以及HCS2、4和6在近红外（NIR）和短波红外（SWIR）区域均有发射，其发射最大值分别位于806、952、768、861和1010纳米处。与HCO2（约715纳米）相比，这些数值对应的红移分别约为91、237、53、146和295纳米，这与上述先前报道的结构-性质关系一致，凸显了它们在短波红外成像中的潜力。通过在水溶液（1×PBS，pH=4-10）中不同pH值范围内的紫外-可见滴定法测定了半花菁的pKa值。所有化合物均表现出接近中性的pKa值，范围为6.9至7.5，这表明在生理条件下，荧光团部分以去质子化形式存在。同时，这些新设计的荧光团在二氯甲烷（DCM）中表现出强发射性，其荧光量子产率（QYs）中，HCO2–6分别为18.9%、16.1%和1.96%，而HCS2–HCS6分别为13.7%、3.47%和1.17%。
荧光成像
为进一步提高其在体内成像中的生物相容性，HCO2和HCS6与聚乙二醇（PEG）链（分子量=2000）进行了偶联，分别得到水溶性染料HCO2-PEG2k和HCS6-PEG2k。通过核磁共振氢谱（¹H NMR）表征证实了聚乙二醇化的成功。聚乙二醇化对分子核心的光物理性质影响极小。首先在体外测试了这两种染料产生的荧光信号。在近红外窗口（激发波长675 nm，带通滤光片740 nm）和短波红外窗口（激发波长808 nm，长通滤光片950 nm）下，对PBS中含20%二甲基亚砜（DMSO）的HCO2-PEG2k和HCS6-PEG2k混合溶液（各5μM）进行了体模成像。两种染料之间的信号串扰可忽略不计。研究了HCS6产生的短波红外（SWIR）信号在未剃毛活体小鼠肺部的深层组织成像能力。将含有HCO2-PEG2k和HCS6-PEG2k（各1.25μmol/kg）的溶液通过气管内给药，并在近红外（NIR）窗口（激发光675nm，740nm长通滤波）和SWIR窗口（激发光808nm，950nm长通滤波）下对肺部区域的荧光信号进行采集和量化。在未剃毛的情况下，肺部区域的近红外荧光几乎检测不到，肺部信号接近背景信号。相比之下，SWIR信号由于其优异的深层组织穿透能力，能清晰定位未剃毛小鼠模型的肺部。从定量角度看，腹侧的SWIR信号背景比（SBR）达到13.7–20.8，背侧为5.0–6.1，显著超过罗斯判据。(51,52)传统上，在小鼠模型的在体荧光成像中，通常需要使用裸鼠，或对有毛小鼠进行剃毛或化学脱毛，以减少信号干扰，因为毛发会吸收和散射可见光及近红外光(53)，而SWIR光在“生物透明窗口”中的穿透效果更好。由于HCS6-PEG2k具有强SWIR发射特性，它能够在无需剃毛的情况下对活体小鼠进行肺部成像。
肺转移特异性SWIIR探针的合成与研究
为实现精准的癌症诊断，研究人员构建了一种荧光近红外二区（SWIR）成像探针（SWIMP），该探针可对促进肺肿瘤进展的癌症生物标志物组织蛋白酶B（Cath B）产生响应。聚乙二醇化的HCS6通过N,N'-二甲基乙二胺对氨基苄基氨基甲酸酯自牺牲连接子，与Cath B响应性肽序列乙酰基-缬氨酸-瓜氨酸（Ac-Val-Cit）进行笼化。通过该合成方法可对肽序列进行修饰，以适应不同的生物标志物。在笼化状态下，由于分子内电荷转移（ICT）减弱，SWIMP不发荧光（在水溶液中的最大吸收峰位于663 nm处）。在Cath B存在的情况下，SWIMP的Ac-Val-Cit部分发生切割，随后启动级联自牺牲过程，生成酚氧阴离子并恢复HCS6的ICT，这一点已通过高效液相色谱（HPLC）分析得到证实（HCS6的保留时间TR=12.3分钟，SWIMP的保留时间TR=15.3分钟）。与Cath B孵育2小时后，SWIMP的吸收峰发生红移，移至773/962 nm处，这使得在体内研究中可使用808 nm激光进行激发，且其在988 nm处的荧光强度增加了13.5倍（HPLC证实约20%的探针发生了切割）。此外，在Cath B抑制剂（CA-074）存在时，SWIMP的荧光开启受到抑制。相比之下，当SWIMP与其他酶（包括γ-谷氨酰转移酶（GGT）、氨肽酶N（APN）、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶（NAG）、β-半乳糖苷酶（β-gal）和硝基还原酶（NTR））孵育时，其荧光强度几乎没有增强，这表明SWIMP对Cath B具有高选择性。我们进一步在组织蛋白酶B阳性（Cath B+）的4T1细胞以及作为对照的组织蛋白酶B阴性（Cath B–）的NIH-3T3细胞中测试了SWIMP的荧光开启响应。值得注意的是，将SWIMP与4T1细胞、3T3细胞以及经组织蛋白酶B抑制剂处理的4T1细胞共同孵育24小时后，其细胞毒性可忽略不计，这表明它具有良好的细胞相容性。孵育3小时后，在4T1细胞的细胞质中检测到强烈的短波红外（SWIR）荧光，其强度分别是3T3细胞和经组织蛋白酶B抑制剂处理的4T1细胞的51倍和15倍。此外，在骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）中，荧光激活现象明显但较弱（比孵育了SWIMP的4T1细胞低4倍），而肿瘤相关中性粒细胞（TANs）中则仅观察到极微弱甚至可忽略的荧光，这进一步证实了SWIMP的激活机制依赖于组织蛋白酶B。
肺转移的在体SWIR成像
在4T1肺癌转移未脱毛荷瘤小鼠中对SWIMP进行了评估。将5×10⁶个荧光素酶转染的4T1细胞静脉注射到小鼠体内（n=3）。7天后，通过腹腔注射d-荧光素，利用生物发光确认肿瘤成功植入。随后，气管内给予SWIMP以进行实时成像，每2小时对小鼠进行一次成像（808 nm激发，900 nm长通滤光片）。来自肿瘤的短波红外信号逐渐增强，在注射后8小时达到峰值，从小鼠的腹侧和背侧观察，与PBS预处理的小鼠相比，分别增加了7.4倍和4.3倍。此外，信噪比（SBR，定义为肺肿瘤部位相对于皮肤的信号）随时间进行监测，其趋势与短波红外强度相似。注射后8小时，SWIMP注射组小鼠腹侧的平均信噪比为15，背侧为9.3。此外，当小鼠预先用CA-074处理后，肿瘤部位的SWIMP信号增强在腹侧降低了1.4倍，背侧降低了1.2倍。，在无肿瘤小鼠中使用相同剂量的SWIMP进行了对照实验，结果显示与SWIMP处理的荷瘤组相比，荧光激活可忽略不计。在注射后12小时处死小鼠；离体分析进一步证实SWIMP在肺中被特异性激活，其信号比抑制剂预处理组高24.3倍。
总结
我们通过高效的合成流程开发出一系列半花菁化合物，确定HCS6为具有代表性的短波红外荧光团，并发现其能够在活体、无需脱毛的小鼠模型中实现肺部深层成像。我们利用吲哚-呫吨醛的克脑文盖尔缩合反应合成半花菁，通过一锅法维蒂希反应延长醛前体的每个次甲基键，简化了合成过程并将产率提高了33%-45%。在所有六种荧光团中，具有三个重复共轭次甲基双键的HCS6在短波红外区域表现出最长的发射峰值（1010 nm），同时具备良好的光稳定性（k = 0.058）和较高的亮度（在二甲基亚砜中的量子产率为2.60%）。它能显著增强光子穿透深度，可对未脱毛小鼠的肺部进行可视化成像，其腹侧的信噪比达到13.7-20.8，背侧为5.0-6.1，超过了近红外对照染料HCO2的性能（HCO2腹侧信噪比为1.1-2.4，背侧为0.9-1.1）。
参考文献
Shortwave Infrared Hemicyanine 6 for Cancer-Activated and Shaving-Free Preclinical Imaging of Lung Metastasis, Hanyu Yang, Donghao Li, Jiayan Wu, Kanyi Pu*, J. Am. Chem. Soc., 2025, 147, 30794−30802，https://doi.org/10.1021/jacs.5c06682
