内容提要
⼀种新型荧光探针QST-GAL，通过在喹啉基近红外染料中引⼊磺酸基来改善亲⽔性，并通过加⼊噻吩⽚段来扩展共轭体系。这些基团的存在增强了探针的分⼦内电荷转移。在最佳条件下，QST-GAL的线性检测范围为2~28 U/mL，低检出限为0.377 U/mL。细胞实验证实，该探针具有可视化乳腺癌细胞和监测化疗诱导衰⽼的能⼒。在乳腺癌⼩⿏模型中，QST-GAL成功⽤于体内肿瘤成像、荧光引导⼿术切除以及帕博西尼治疗效果的准确评估。
结果与讨论
QST-GAL的分析性能
以QST-OH为荧光基团，d-半乳糖为识别基团，合成了β-gal特异性荧光探针。为了验证探针的可⾏性，并评估其选择性检测β-gal活性的能⼒，⾸先进⾏了体外实验。⾸先，研究了QST-OH及其前体QST-GAL的光谱性质。QST-GAL在可⻅光范围内没有明显的吸收，⽽QST-OH在460 nm处有明显的吸收峰，摩尔消光系数(ε 460=9.12mM−1cm−1)，表明有效的π‒π*跃迁。QST-OH在710 nm处表现出很强的荧光发射，绝对量⼦产率为0.10，⽽QST-GAL⼏乎保持⽆荧光(Φ<0.01)，表明酶激活后具有良好的荧光响应。在β-gal浓度为2~28 U/mL的范围内，探针的灵敏度较⾼，线性相关系数R2=0.998。还评估了QST-GAL的检出限(LOD)，发现它在0.377 U/mL。采⽤Michaelis-menten和Lineweaver-Burk对QST-GAL和β-gal之间的酶动⼒学进⾏了研究，确定了最⼤反应速度(Vmax)为8.063 μMmin−1，Michaelis常数(Km)为4.792 μM，酶催化常数(Kcat)为0.806minQST-GAL与β-gal之间的⾼亲和⼒和⾼效催化作⽤。为了评估对β-gal的选择性，测试了QST-GAL在各种潜在⼲扰物的存在下，包括氨基酸，⾦属离⼦、阴离⼦和硫醇。该探针对β-gal表现出⾼选择性。这些结果证明了QST-GAL对β-gal的⾼敏感性，增强了其对β-gal敏感和特异性检测的潜⼒。
光谱性质及反应机理
根据上述结果发现，QST-GAL最初并没有表现出明显的荧光信号。然⽽，加⼊β-gal后，荧光强度逐渐增加，发射峰位移与QST-OH相似。基于这⼀观察，假设在β-gal的催化下，QSTGAL发⽣⽔解，导致D-π-A结构中的羟基释放出来，成为强电⼦供体。该反应增强了分⼦内电荷转移(ICT)效应，显著提⾼了荧光强度。具体来说，⽔解反应促进了QST-GAL中酚羟基的释放，从⽽增强了ICT效应，导致710 nm处的荧光强度⼤幅增加。为了进⼀步验证这些发现，对该反应进⾏了⾼效液相⾊谱-质谱(HPLC-MS)分析。最初，没有β-gal，质谱分析仅显⽰QST-GAL信号。加⼊β-gal后，QST-OH和QST-GAL信号均出现，但QST-OH信号更为突出。为了进⼀步证实这⼀结果，通过液相⾊谱-质谱法进⾏了额外的分析。QST-OH和QST-GAL的滞留时间分别为3.31 min和2.59 min。在这些保留时间内，还观察到两个不同的⾊谱峰对应于QST-OH和QST-GAL。HPLC-MS分析进⼀步证实了酶介导的反应机制。
药物诱导细胞衰⽼的荧光成像
采⽤CCK-8法测定QST-GAL和QST-OH的细胞活⼒。结果显⽰细胞存活率超过85%，提⽰QST-GAL和QST-OH具有低细胞毒性。溶⾎实验进⼀步证实，QST-GAL和QST-OH具有较低的溶⾎率，具有较⾼的⽣物相容性。为了验证QST-GAL监测细胞衰⽼的能⼒，⾸先评估了其成像内源性β-gal的性能和特异性。在实验中，使⽤QST-GAL探针对乳腺癌细胞进⾏成像。结果显⽰，细胞中的荧光信号随着时间的推移⽽增加，表明该探针有效地标记了乳腺癌细胞。为了证实荧光信号来源于β-gal活性，在实验中引⼊了d-半乳糖(⼀种β-gal抑制剂)。结果显⽰，与对照组相⽐，抑制剂处理组的荧光强度显著降低，验证了QST-GAL探针对内源性β-gal的⾼特异性。通过使⽤帕博西尼(palbociclib)治疗乳腺癌细胞建⽴细胞衰⽼模型，帕博西尼是⼀种已知可诱导细胞周期阻滞并引发细胞衰⽼的化疗药物。处理后的细胞表现出典型的衰⽼相关形态学变化，如细胞⼤⼩增加、形状变平和核结构改变。X-GAL染⾊是验证衰⽼细胞模型建⽴的经典⽅法。对细胞进⾏X-GAL染⾊，在衰⽼细胞中观察到蓝⾊信号，⽽在正常细胞中未观察到蓝⾊信号，证实模型构建成功。为了进⼀步验证QST-GAL的亚细胞定位，进⾏了额外的溶酶体共定位实验。具体来说，本研究中使⽤的细胞系和药物诱导的衰⽼细胞模型都⽤商业溶酶体追踪器Lyso-Tracker共同染⾊。QST-GAL与Lyso-Tracker在两种细胞类型中均表现出⾼度重叠，Pearson相关系数分别为0.843和0.787。这些结果表明，QST-GAL具有良好的溶酶体靶向能⼒。为了进⼀步验证发现的可靠性，将探针检测结果与单细胞⽔平上已建⽴的细胞衰⽼标记物相关联。采⽤免疫染⾊法观察衰⽼标志物p16和LaminB1的表达变化。由于固定后β-gal活性保持不变，因此在免疫染⾊前，palbociclib处理和未处理的乳腺癌细胞都⽤多聚甲醛固定。然后共施QST-GAL探针，30min后记录其荧光信号。结果显⽰，衰⽼细胞中QST-GAL的红⾊荧光明显增加，LaminB1表达明显降低，p16表达明显增加。QST-GAL荧光强度与p16表达⽔平呈正相关。这些发现共同证实，QST-GAL探针是衰⽼相关β-gal活性的可靠指标，可以有效评估细胞衰⽼状态。
小⿏乳腺癌和衰⽼模型的荧光成像
为了评估QST-GAL探针在体内的成像潜⼒，建⽴了乳腺癌异位瘤模型。在⼩⿏背区肿瘤建⽴后，将QST-GAL探针直接注射到肿瘤部位，对照组相应部位给予相同剂量。在肿瘤部位观察到明显的荧光信号。通过这种荧光引导成像，⼿术切除了肿瘤，并确保了所有⾼荧光区域的完全切除。为了进⼀步表征切除样本中正常组织的存在，使⽤苏⽊精和伊红(HE)染⾊进⾏组织学分析。切除的组织主要由肿瘤细胞组成，只有少量正常组织存在于周围。总之，QST-GAL探针成功地原位成像⼩⿏乳腺癌，并促进精确的⼿术切除。它显⽰出作为临床肿瘤⼿术辅助⼯具的前景。将4T1细胞植⼊年轻⼈的左乳腺脂肪垫雌性BALB/c-nu⼩⿏建⽴原位乳腺癌模型。然后以0、10、50、100和150 mg/kg的剂量⼝服帕博西尼7天。随着药物浓度的增加，肿瘤体积显著减⼩，⽬测可⻅。荧光成像采⽤QST-GAL探针，通过腹腔注射给药。荧光强度随药物浓度的增加⽽显著增加，表明药物浓度与诱导衰⽼的荧光信号呈正相关。这种荧光信号反映了药物诱导的细胞衰⽼，探针选择性地检测衰⽼细胞。较⾼的palbociclib浓度导致肿瘤体积缩⼩，荧光信号增强，表明QST-GAL与palbociclib治疗呈正相关。这些发现突出了QST-GAL探针作为评估帕博西尼治疗乳腺癌疗效的有价值的⼯具。在安乐死后，收集主要器官和肿瘤组织进⾏荧光成像。在肝脏和肠道以及膀胱和肾脏中检测到明显的荧光信号，进⼀步证实了探针亲⽔性的改变。
结论
我们设计并合成了⼀种能灵敏检测β-gal的酶响应荧光探针QST-GAL。该探针在复杂⽣理环境下具有优异的成像能⼒。通过引⼊磺酸基来增强其亲⽔性，我们提⾼了探针的灵敏度，并成功启⽤了“off-on”ICT效应，从⽽产⽣了低背景荧光。体外和细胞实验证实，QST-GAL有效成像乳腺癌细胞和监测药物诱导的细胞衰⽼。在体内实验中，该探针成功地促进了乳腺癌⼩⿏模型的肿瘤成像，并间接评估了化疗效果。这些发现突出了QST-GAL作为乳腺癌成像和早期诊断的有⼒⼯具的潜⼒。
参考文献
In vivo imaging and chemotherapy monitoring of breast cancer with β-galactosidase-activated fluorescence probe ，Jingkang Li , Chen Zhao , Mo Ma , Lanyun Zhang , Wanqi Li , Pinyi Ma, , Qiong Wu ，Daqian Song ，Sens. Actuators B Chem.，2025，138418，https://doi.org/10.1016/j.snb.2025.138418
