内容提要
本研究开发ZNH-Vis探针利用膜张力变化实现焦亡过程中膜动力学的实时监测。探针的烷基脂肪酸链赋予其强亲脂性，而吡啶丙烷磺酸基团则增强其在细胞膜上的滞留能力。探针中的碳碳双键可响应膜张力改变，在低粘度环境中表现为无荧光状态，而在粘度升高条件下则呈现荧光增强特性。通过氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型和大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型，我们验证了ZNH-Vis对中风诱发焦亡的精准检测能力。
结果与讨论
荧光探针ZNH-Vis的设计、合成以及光谱响应特性
ZNH-Vis的烷基脂肪链组分赋予其显著的亲脂性，从而增强了探针与细胞膜的亲和力。此外，考虑到细胞膜带负电荷的特性，我们引入了吡啶丙烷磺酸基团。在该设计中，带正电荷的吡啶盐部分有助于探针成功穿越细胞膜，而带负电荷的磺酸基团则阻止探针穿膜，从而确保其滞留在膜上，显著延长其在膜界面的驻留时间。值得注意的是，两个碳碳双键的引入不仅增加了探针的共轭性（导致吸收和发射波长红移），还增强了其旋转自由度，这有助于降低背景荧光信号。吸收光谱实验表明，在0-20 μM浓度范围内，吸收强度呈现线性关系，表明ZNH-Vis在此浓度区间保持优异溶解性。为深入研究ZNH-Vis与膜张力的关系，我们采用甘油/PBS体系考察ZNH-Vis对粘度变化的光谱响应（该参数可间接反映膜张力变化）。在PBS-甘油溶液中系统研究了ZNH-Vis的光谱特性：甘油环境下445 nm处出现强吸收峰，而该峰在PBS缓冲液（10 mM，pH 7.4，含0.9% NaCl）中几乎不可检测。当以445 nm激发时，ZNH-Vis在PBS中670 nm处荧光微弱（Φ < 0.001），但在甘油环境中670 nm荧光强度显著增强。滴定实验进一步揭示，ZNH-Vis在PBS缓冲液（10 mM，pH 7.4，含0.9% NaCl）中几乎不显示荧光发射，而在甘油溶液中于670 nm处出现显著荧光发射峰，其荧光强度提升约315倍（激发波长λex = 445 nm），斯托克斯位移达125 nm。这些结果明确证实ZNH-Vis对溶剂粘度具有高度敏感性。最后，我们评估了细胞内物质对ZNH-Vis荧光的潜在干扰。无论探针处于高粘度（甘油）还是低粘度（PBS）环境，Fe²⁺、Fe³⁺、K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Cys、GSH、Sec、H₂S、SO₂、HClO、H₂O₂、·OH、NO、NO₂⁻和ONOO⁻等物质均未改变探针的荧光强度。这些发现清晰表明该探针具备卓越的抗干扰能力，可实现细胞粘度的精准原位成像分析。最终，我们考察了pH值对PM-Red粘度响应的影响。在pH 7.0至8.5范围内，ZNH-Vis与甘油作用时荧光信号基本保持稳定。
ZNH-Vis活细胞生物成像
体外实验证实，ZNH-Vis具有黏度敏感性特性，这使我们推测该探针能够动态感知细胞焦亡过程中胞质膜张力的变化，从而实现对焦亡程度的精准评估。在进行细胞共聚焦成像前，我们首先考察了ZNH-Vis的细胞毒性。将BV-2细胞与ZNH-Vis（0-20 μM）共孵育24小时后，细胞存活率始终保持在90%以上，表明ZNH-Vis几乎不产生细胞毒性，可作为后续细胞实验的可靠工具。通过共聚焦成像对ZNH-Vis进行持续激发，在60分钟内监测三个不同位置细胞的荧光强度，仅观察到微弱变化，证明ZNH-Vis具有优异的光稳定性，适用于长期细胞成像。
随后，我们评估了ZNH-Vis的细胞膜定位能力。将ZNH-Vis与BV-2细胞孵育20分钟后进行共聚焦成像，ZNH-Vis显示出显著的红色荧光，而细胞核与细胞质中均未观察到荧光信号。为进一步验证其膜靶向能力，我们采用商品化细胞膜染料（绿色染料Dio）对细胞膜进行特异性标记。将两个荧光通道的成像区域叠加后，观察到ZNH-Vis与商品化膜染料具有出色的共定位效果。经定量分析，绿红通道间的皮尔逊共定位系数达到0.89。这些结果证实ZNH-Vis能特异性靶向细胞膜，为其作为研究细胞过程中膜动力学的工具提供了有力证据。
现有文献报道显示，脂多糖与尼日利亚菌素偶联物（LPS-Nig）可诱导细胞发生焦亡。为深入探究ZNH-Vis探针在监测焦亡过程中的应用价值，本研究整合多维检测方法系统阐释LPS-Nig诱导焦亡的动态过程与分子机制。假手术组被细分为两种实验条件：第一组作为对照组，BV-2细胞不作任何干预；第二组则采用焦亡抑制剂VX-765进行处理。在假手术组中观察到强烈的红色荧光，表明VX-765处理未破坏BV-2细胞的完整性。当使用ZNH-Vis监测焦亡过程时，LPS-Nig组出现红色荧光强度的显著降低。为确证该荧光变化确实源于焦亡程度增加，我们分别用10 μM VX-765对细胞进行1小时、4小时和12小时预处理。正如预期，随着VX-765处理时间的延长，细胞荧光强度呈现明显回升。确凿证据表明，ZNH-Vis具有高灵敏度，能有效检测细胞焦亡程度。通过ELISA进一步验证了炎症细胞因子的时序性释放。在LPS-Nig组中，IL-1β分泌量达到985.7±32.1 pg/mL，较假手术对照组（128.5±4.2 pg/mL）升高7.7倍，而TNF-α水平仅小幅上升（模型组820.3±7.6 pg/mL vs 对照组119.8±3.1 pg/mL）。这种释放模式与荧光强度恢复呈显著负相关，提示TNF-α主要受NF-κB通路调控。该发现证实了膜孔形成与炎症因子释放间的因果关系。ZNH-Vis还被用于监测氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）过程中与焦亡密切相关的膜张力变化。BV-2小胶质细胞在OGD/R条件下模拟缺血再灌注，同时通过ZNH-Vis持续监测膜张力。将假手术组进一步细分为两种实验条件：第一亚组为未干预的BV-2细胞对照组，第二亚组为VX-765处理的BV-2细胞。假手术组观察到强烈红色荧光，表明VX-765处理未影响BV-2细胞完整性。使用ZNH-Vis监测OGD/R过程中的焦亡时，发现OGD/R组红色通道荧光强度较假手术组显著降低。为确认荧光减弱源于焦亡水平下降，实验前分别用10 μM VX-765预处理细胞1、4和12小时。正如预期，随着VX-765处理时间延长，细胞荧光强度显著回升。Western blot对关键分子事件的分析显示：OGD/R组NLRP3蛋白表达上调3.2倍，Caspase-1切割产物增加4.1倍，Gasdermin D片段生成达模型组的4.8倍，与LPS-Nig模型高度吻合。Caspase-1抑制剂VX-765使NLRP3、Caspase-1 p10和Gasdermin D表达分别降至基线水平的0.4、0.5和0.6倍，表明VX-765通过抑制Caspase-1活化发挥对焦亡的调控作用。ELISA检测进一步佐证了这一结论。
小鼠脑卒中体内成像
在阐明缺血再灌注与细胞焦亡的关系后，我们采用大脑中动脉闭塞（MCAO）模型模拟小鼠脑卒中。成像前静脉注射200 µM ZNH-Vis（100 µL），并通过苏木精-伊红（H&E）染色评估探针在脑、心、肝、脾、肺、肾等多组织的生物相容性。注射探针后未观察到显著器官或组织损伤，表明ZNH-Vis具有优异的组织相容性，适用于小鼠活体成像分析。随后系列荧光成像显示静脉给药后ZNH-Vis在活体小鼠体内的动态迁移。30分钟时荧光强度达到峰值，与脑部荧光热点区域同步。30分钟后开始清除过程，150分钟时信号衰减至接近背景水平。本研究利用小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，将活体成像与分子-功能多维分析相结合，系统阐明了细胞焦亡的时空动态及其在缺血性脑损伤中的治疗干预效果。假手术组中，未处理对照组和VX-765预处理组均表现出稳定的脑内红色荧光，表明Caspase-1抑制剂在生理条件下未显著破坏神经元膜完整性。相比之下，MCAO模型组在缺血核心区表现出荧光强度的显著降低，这与由GSDMD孔道形成介导的ZNH-Vis探针扩散直接相关。值得注意的是，VX-765干预组（MCAO手术前一天给药）显示出荧光恢复，这一变化与焦亡进程的抑制高度一致，从而验证了该探针在体内焦亡检测中的特异性。功能分析进一步揭示了病理生理相关性：MCAO组小鼠表现出神经功能评分的显著恶化，而激光散斑成像显示缺血区域脑血流量明显下降。，TTC染色证实梗死脑区占比达31.7±3.8%。相比之下，VX-765治疗组显著逆转了这些表型特征：将神经功能评分改善至3.2±0.4（p<0.001）、恢复脑血流量、并将梗死面积缩小至24.5±2.6%，其疗效与荧光恢复强度呈强相关性。分子水平上，蛋白质印迹分析显示MCAO组中NLRP3、GSDMD-NT、活化型Caspase-1及成熟IL-1β显著上调，而VX-765干预使这些标志物明显减少，证实Caspase-1/GSDMD轴是缺血性细胞焦亡的核心驱动因素。组织病理学与细胞学证据进一步佐证治疗效果：尼氏染色显示MCAO组皮质缺血区神经元损伤伴随尼氏体减少，而VX-765治疗组在抑制焦亡后表现出尼氏体密度增加。这些数据共同构建了"分子激活-膜孔形成-功能障碍-结构损伤"的完整因果链条，阐明VX-765通过靶向抑制Caspase-1活性阻断焦亡级联反应，从而改善缺血性脑损伤的病理进程，为卒中治疗提供了兼具机制深度与转化潜力的实验依据。最终证实ZNH-Vis作为MCAO诱导细胞焦亡的杰出近红外荧光成像探针，为卒中及相关疾病研究提供了关键技术支撑。
结论
本研究成功设计并合成了一种新型近红外(NIR)荧光探针ZNH-Vis，专为分析大脑中动脉闭塞(MCAO)小鼠模型中的细胞焦亡水平而开发。该探针展现出优异的近红外荧光发射(650nm)、极低的背景信号以及显著的膜张力响应特性，响应因子高达315倍。此外，ZNH-Vis的烷基脂肪酸链组分赋予其强亲脂性，从而增强了探针对细胞膜的亲和力；同时通过引入吡啶丙烷磺酸基团，我们利用了细胞膜的负电荷特性。带正电荷的吡啶盐部分促使探针高效跨膜，而带负电荷的磺酸基团则阻止膜穿透，确保探针锚定在膜上并显著提高其保留率(PCC=0.89)。体外实验表明ZNH-Vis对粘度具有高度敏感性.该材料具有显著的pH稳定性，且表现出低细胞毒性。在氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型和MCAO小鼠模型中，ZNH-Vis探针能准确检测细胞焦亡水平的动态变化，为深入研究这一病理机制提供了可靠工具。研究还发现VX-765通过有效抑制细胞焦亡程度，在中风保护中发挥关键作用，从而显著减轻中风引发的病理损伤。这一发现进一步印证了ZNH-Vis在中风及相关疾病诊断研究中的广泛潜力。
参考文献
Tracking pyroptosis in stroke models via membrane tension-sensitive near-infrared fluorescent probe , Wen Liu, Pan Nie, Chenguang Jia, Wei Hu, Jincao Chen, Rui Gong, Kui Liu, Sens. Actuators. B 446 (2026) 138690,https://doi.org/10.1016/j.snb.2025.138690
