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内容提要

   本研究基于基础蓝3染料开发了一种新型双锁控荧光探针（H_dual）。该探针设计为通过级联机制逐步被两种潜在肝病生物标志物—亮氨酸氨肽酶（LAP）和单胺氧化酶（MAO）激活。此外，在加入LAP和MAO后，H_dual在pH范围6.2–6.8内表现出线性荧光变化，确保与肝病特有的弱酸性微环境高度兼容。双级级联激活设计结合探针的微环境适应特性，使H_dual在药物性肝损伤体内成像中实现了显著更高的目标信号与噪声比（T/N）为2.40，相比“单锁”探针（T/N < 0.79）具有明显优势。值得注意的是，通过分析患者血液样本，H_dual能够通过荧光成像及明显的比色变化（可通过肉眼或基于智能手机的颜色分析观察）区分肝硬化与乙型肝炎样本。

结果与讨论

双级可激活荧光探针的构建及其对LAP/MAO的光学响应

   我们选择了近红外荧光染料基础蓝3（Basic Blue 3, BB3, λ_ex = 630 nm，λ_em= 676 nm），这是由于其优越的发射特性。此前在我们的早期研究中，这种染料已被用于开发酶响应型探针，应用于体内成像和血清学检测等场合。BB3 的还原型无荧光且具有吸收性，而氧化型具有强荧光和吸收性。所选染料的独特性质使其在被引入 4-羟基苄醇基团作为自我消除芳基连接体时可以实现荧光和吸收的抑制。随后，将 4-羟基苄醇基团与丙胺单元（第二个“锁”）偶联，并通过拟肽键与亮氨酸基团（第一个“锁”）相连，从而完成了 H_dual 的合成。在 LAP（第一个“钥匙”）存在下，拟肽键首先被切割，导致亮氨酸基团暴露。随后发生与 MAO（第二个“钥匙”）的级联反应，通过氧化和 β-消除触发荧光团的释放。H_LAP 和 H_MAO 分别被设计为针对单酶响应的 LAP 或 MAO 的参考探针。我们在生理条件下（10 mM 磷酸盐缓冲液，DMSO 0.25%，测量了探针的详细光物理性质，H _dual 本身几乎没有吸收且在620 nm 激发时几乎不产生荧光。在加入 LAP或 MAO后，仍未观察到显著响应。仅在同时存在 LAP 和 MAO 时，H _dual 出现以 630 nm 为主的新吸收峰以及以 676 nm 为中心的荧光开启，对应自由染料 BB3。荧光强度随时间及 LAP 或 MAO 浓度的增加而增加。在低 LAP 浓度（0–0.08 U/mL，相关系数为 0.99281）且 MAO 为 1 U/mL 时，676 nm 的荧光强度呈线性关系；在低 MAO 浓度（0–0.08 U/mL，相关系数为 0.99009）且 LAP 为 1 U/mL 时也呈线性关系。在 PBS 溶液中，H _dual 的绝对荧光量子产率（Φ_F）在酶促反应后从 0.04% 提高到 1.00%，显示出荧光发射效率显著增强。H _LAP探针无荧光且无吸收峰。暴露于 LAP 时，在 630 nm 出现明显的吸收峰并出现 676 nm 的新荧光峰。荧光强度与 LAP 浓度之间呈良好线性关系，检测限（LOD）为 0.512 mU/mL，显示其对 LAP 的超高灵敏度，与先前报道的其他工作相比（表 S1）。H _MAO 对 MAO 也有类似的结果。为了研究干扰，探针与多种物质的反应被测试，包括几种无机盐、活性氧物种、活性硫物种或其他酶。H _dual 仅在同时存在 LAP 和 MAO 的情况下表现出最强且最明显的红色荧光增强（50.0 倍）。在缺少任一酶的情况下，H _dual 的荧光没有变化。此外，H _dual 对其他干扰分析物的荧光响应可忽略不计，表明其对 LAP 和 MAO 的激活通道具有高特异性。相比之下，单锁探针 H _LAP 或 H _MAO 在仅存在 LAP 或 MAO 的情况下分别显示出 48.8 倍或 201.0 倍的荧光增强，表明 H _LAP 或 H _MAO 可以作为特定的单酶检测分子探针。这些结果表明 具有优异的光谱特性和抗干扰性能，满足在复杂生物体系中精确检测的需求。

探针对不同pH条件的兼容性评估

   我们统计分析了38份血清样本，其中19份来自肝硬化患者，其余来自健康个体。肝硬化样本的总胆汁酸相比健康样本增加了13.90倍。在肝硬化组的19份样本中，有15份的总胆汁酸平均水平高于医学参考范围（0–10 μmol/L）。这些结果表明，肝硬化微环境是酸性的，这可能与胆汁酸代谢异常有关。然而，先前报道的LAP和/或MAO探针的最佳pH水平为中性或碱性；这些工作条件与肝病的微弱酸性微环境不兼容。因此，我们在本研究中探讨了设计探针在pH为6.0–8.0的生理环境下的性能及酶响应。值得注意的是，添加LAP和MAO后，H _dual在pH为6.2–6.8范围内表现出线性荧光变化（R = 0.98004，）。然而，当pH超过6.8时，H _dual的荧光强度明显下降，提示其最适合弱酸性条件。相比之下，添加LAP后，H _LAP在 pH 6.6 到 7.6 之间表现出线性荧光（R = 0.98998，），能够在近中性条件下实现可靠的 LAP 监测，这与其他先前报道的工作相似。在生理 pH 范围内，H _MAO 对 MAO 保持了强烈的响应。

活细胞中探针对LAP和MAO的光学检测能力评估

   为了探讨探针的生物相容性，在体内实验之前进行了体外研究。我们选择了Hepa1-6细胞（肝癌细胞）和HL7702细胞（正常肝细胞）作为研究对象。在活细胞成像之前，使用CCK-8试剂盒测试了探针的细胞毒性。在将Hepa1-6细胞与1–10 μM探针孵育5或10小时后，细胞存活率超过90%，这表明探针具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性。在细胞成像实验中，与 H_dual (10 μM) 共孵育的 Hepa1-6 细胞在红色荧光通道 (680 ±30 nm) 的荧光信号在 633 nm 激发波长下逐渐增加，4 小时内增强了约 41 倍，显示了该探针良好的细胞通透性以及与细胞内 LAP 和 MAO 的反应。为了进一步研究H_dual对LAP和MAO的特异性级联响应，在Hepa1-6细胞中进行了抑制实验。将探针孵育的Hepa1-6细胞分别预处理30分钟，使用ubenimex（已知的LAP抑制剂）或pargyline（已知的MAO抑制剂）。加入ubenimex或pargyline后，红色荧光强度显著降低，且具有统计学显著性（ubenimex **p < 0.01，pargyline ***p < 0.001，），表明荧光强度确实来自H_dual与LAP和MAO的反应。对于HLAP和HMAO，分别在4小时内观察到强荧光。此外，Hepa1-6细胞中H_LAP和H_MAO的红色荧光也可分别被ubenimex（*p < 0.05）或pargyline（****p < 0.0001）抑制。为了验证 H_dual 在药物诱导损伤成像中的可行，我们使用 H_dual、H_LAP 和 H_MAO 与正常肝细胞系 HL7702 细胞共同孵育。在载入 H_dual 的 HL7702 细胞中几乎观察不到荧光信号。相比之下，细胞在与 H_LAP 或 H_MAO 孵育后显示出明显的信号，这确认了 H_dual 在正常肝细胞中具有低噪声信号。此外，我们测试了 H_dual 检测 HL7702 细胞中由对乙酰氨基酚（APAP，一种常用的退热镇痛药及药物诱导的细胞损伤模型化合物）引起的药物诱导细胞损伤的有效性。载有 H_dual 的 HL7702 细胞被预先与 250 μM APAP 孵育 12 小时，荧光显著增强了 13.9 倍 (**p < 0.01)。相比之下，APAP 处理并未引起 H_LAP 或 H_MAO 荧光强度的可检测变化。这些结果表明，H_dual 是一种检测药物诱导损伤的高效工具，并且表明双级级联激活探针 H_dual 的准确性远高于单酶响应探针，如 H_LAP 和 H_MAO。

体内肝损伤可视化

   H_dual 在细胞中表现出优异的光谱学和成像特性，因此我们进一步使用 H_dual 对由 APAP 引起的 DILI 模型小鼠进行精确成像。成像结果显示，在将 H_dual 静脉注射到接受 APAP 处理的模型小鼠后，荧光信号迅速增加，并在 30 分钟时达到最大值。H_LAP 在 APAP 处理的小鼠中表现出缓慢的荧光增强。在静脉注射 H_MAO 后，APAP 处理模型小鼠与对照小鼠的荧光强度没有显著差异。通过定量分析，从给药 0 分钟到 30 分钟，H_dual 的荧光增强为 2.29 倍，相比之下，HLAP 为 1.55 倍增强，H_MAO 几乎没有变化。此外，我们还探索了探针在体内的生物分布。结果显示，H_dual 主要在肝脏中积累。相比之下，HLAP 静脉注射后主要分布在肾脏。此外，肝脏区域的定量数据也显示，H_dual 在体内成像中表现出更高的目标信噪比 [T/N, 2.40，表示 DILI 组肝/肾的荧光强度比对照组高]，而“单锁”探针的 T/N <0.79。这些数据再次证明，双酶响应探针 H_dual 在 DILI 成像中比单酶响应探针具有更高的准确性。另外，对肝组织进行了组织学 H&E 染色，以识别 APAP 处理小鼠与对照组的组织学变化。进一步的 H&E 染色结果显示，在 H_dual 给药后组织学变化极少，表明该探针具有优异的生物相容性。

结论

   H_dual是一种特定的双重锁控制荧光探针，已成功设计并合成，用于肝病的精确成像和区分。该探针通过级联激活释放在两种潜在肝病生物标志物——LAP 和 MAO 存在的情况下，亮红色荧光在 676 nm 处最为显著。此外，其微酸性的检测范围确保了与肝病典型的弱酸性微环境高度兼容，从而提高了在疾病相关条件下的诊断准确性。利用双级级联激活、适应微环境的性能，H_dual在药物诱导肝损伤模型的体内成像中表现出明显高于单锁探针（T/N < 0.79）的靶标信噪比（T/N, 2.40）。这种卓越性能凸显了其在精准可靠的疾病检测中的潜力。

参考文献

A dual-cascade-activatable molecular probe with microenvironment-adapted performance for accurate differentiation of hepatopathy, Ying Wen, Zefeng Hu, Wenhao Tian, Huming Yan , Fangjun Huo, Caixia Yin, Biomaterials, 322 (2025) 123382，https://doi. org/10.1016/j.biomaterials.2025.123382