内容提要
本研究报道一种针对COX-2的近红外荧光(NIRF)探针MB-COX。MB-COX是通过将近红外发色团亚甲蓝(MB)与COX-2抑制剂吲哚美辛(INM)偶联而制成的。由于分子内MB的π共轭结构被破坏，MB-COX表现出可忽略不计的背景荧光，但在ONOO-存在时迅速恢复。MB-COX具有超低检测限、优异的选择性和良好的响应度。使用MB-COX，成功观察到LPS/D-GalN诱导的ALF细胞模型中ONOO-水平的上调，这一发现与NF-κB信号通路的激活以及iNOS、IL-6和COX-2的上调高度一致。此外，在ALF小鼠模型中，MB-COX实现了肝脏ONOO-动态的精确实时可视化，并有助于评估天然类黄酮二氢槲皮素(DHQ)的剂量依赖性保肝作用。
结果与讨论
分子设计
亚甲蓝(MB)是一种经典的吩噻嗪染料，具有平面π共轭骨架，具有出色的光稳定性和高摩尔消光系数。MB已被美国食品和药物管理局(FDA)批准作为临床造影剂。其荧光发射位于近红外区域，该区域的低组织自发荧光和高穿透深度可实现高信噪比的体内成像。在该设计中，MB-COX是通过六亚甲基二胺将MB与吲哚美辛（INM）偶联合成的。MB-COX的化学结构通过NMR和HRMS得到了很好的表征。MB-COX内的酰胺键作为反应位点；该键的断裂破坏了MB的共轭骨架，从而将背景荧光抑制到接近零。在ONOO-存在的情况下，酰胺键的氧化裂解恢复了MB的共轭结构并激活了其荧光。HRMS分析验证了MB-COX对ONOO-的传感机制。在MB-COX与ONOO-反应的混合溶液中，检测到m/z=284.1231的信号，对应于MB的形成。一致地，暴露于ONOO-后，MB-COX的1HNMR谱中出现了与MB相同的新峰。这些结果与ONOO-介导的C-N键断裂的机制高度一致。
MB-COX对ONOO-的光学响应
在PBS缓冲液（pH7.4，1%DMSO）中系统地研究了MB-COX对ONOO-的光学响应。紫外-可见吸收光谱显示MB-COX本身没有表现出明显的吸收峰。随着ONOO-的逐渐添加，出现了一个以664nm为中心的新吸收带，其强度随着ONOO-浓度的增加而增加。相应地，评估了MB-COX对ONOO-的荧光响应。在620nm激发下，在没有ONOO-的情况下，MBCOX显示出可忽略不计的背景荧光。增量添加ONOO-在693nm处诱导开启荧光信号，发射强度与ONOO-浓度成比例增加，并在14μM处接近饱和。在ONOO-浓度范围0至4μM内，693nm处的荧光强度表现出良好的线性相关性，拟合方程F693nm=141.55[ONOO-]+21.68(R2=0.99)，检测限为32.7nM。随后检查了pH对MBCOX对ONOO-响应的影响。在没有ONOO-的情况下，MB-COX的荧光强度在pH3-11范围内表现出最小的变化，表明酸碱环境的干扰可以忽略不计。在ONOO-存在的情况下，MB-COX在pH3-10范围内对ONOO-做出反应，最明显的反应发生在生理pH条件下。鉴于ONOO--的寿命极短，MB-COX的反应动力学得到了进一步研究。反应在大约55秒内完成。评估了MB-COX对ONOO-的选择性。经过ONOO-处理后，仅观察到强烈的荧光增强，远高于其他生物分析物引发的荧光增强，包括阴离子（例如NO3-、Cl-、SO42-、CO32-、I-、S2O32-、AcO-）、金属离子（例如Ca2+、Cu2+、K+、Mg2+、Na+、NH4+、Ni2+、Fe3+）、活性硫物质（例如Cys、GSH、Hcy）和活性氧（例如H2O2、O2-、t-BuOOH、·OH、HOCl）。此外，竞争实验表明MB-COX对其他生物分析物表现出优异的抗干扰能力。总之，这些结果确立了MB-COX作为用于ONOO-检测的高灵敏度和选择性NIRF探针。
活细胞中ONOO-的成像
基于MB-COX的光学特性，随后研究了其细胞内ONOO-的成像能力。在细胞成像之前，评估MB-COX的细胞毒性。MB-COX在浓度低于60μM时对HepG2细胞表现出低毒性。在实验中，3-吗啉代亚胺（SIN-1）被用作外源性ONOO-供体，同时LPS/IFN-γ/PMA的刺激被用来提高内源性ONOO-水平。与对照组相比，SIN-1处理和LPS/IFN-γ/PMA刺激均诱导细胞内荧光显着增强。相反，用公认的ONOO-清除剂氨基胍（AG，一种一氧化氮合酶抑制剂）预处理的细胞发出的荧光信号明显减弱。结果表明MB-COX可被视为一种可靠的可激活NIRF探针，用于可视化活细胞中的ONOO-。
为了验证MB-COX的特异性，进行了COX-2抑制实验。HepG2细胞在与MB-COX一起孵育进行成像之前，用或不用吲哚美辛(INM)和SIN-1共同处理30分钟。用INM和SIN-1共同处理的细胞的荧光信号低于单独用SIN-1处理的细胞，表明INM抑制细胞对MBCOX的摄取。这一结果支持MB-COX信号传导依赖于COX-2活性驱动的ONOO-生成，并验证了其在COX-2过表达细胞中的特异性靶向能力。
在实验研究中，LPS和D-GalN的联合给药构成了建立ALF模型的经典方法。LPS作为内毒素，经门静脉进入肝脏，损害肝功能和代谢；D-GalN作为一种氨基糖，会干扰RNA聚合酶II并抑制肝蛋白合成。它们的协同作用使肝细胞处于“启动状态”，即使是低剂量的LPS也会诱发过度的炎症反应，导致ALF。该模型已在实验肝脏研究中得到广泛验证和应用。受MB-COX优异性能的启发，我们进一步研究了其在LPS/D-GalN诱导的ALF细胞模型中的应用。随着LPS/D-GalN处理时间从0延长到24小时，细胞内荧光信号逐渐增强，在24小时观察到明显增强。核因子kappaB(NF-κB)是一种诱导型转录因子，已知可上调诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，从而导致NO产生过多。NO进一步与O2.-结合生成ONOO-。同时，NF-κB激活促进下游促炎因子白细胞介素6(IL-6)的表达。iNOS、NF-κB和IL-6的上调表明炎症反应的激活。为了验证这些发现，对细胞裂解物进行了蛋白质印迹分析。LPS/D-GalN处理导致iNOS、IL-6和NF-κB蛋白水平随时间依赖性增加，与荧光强度观察到的趋势一致。此外，LPS/D-GalN处理的细胞中COX-2的表达也以时间依赖性方式升高，预计这会增强细胞对MB-COX的摄取。总的来说，这些发现表明LPS/D-GalN诱导的ALF细胞模型中ONOO-水平升高可能与NF-κB信号通路密切相关。
为了可视化DHQ的保护作用，进行了基于细胞的实验。单独用DHQ处理的细胞与对照组相比，荧光强度没有显着差异，表明DHQ本身不会提高细胞内ONOO-水平。相对于LPS/D-GalN诱导的ALF模型组，用DHQ预处理的细胞随着DHQ浓度的增加，荧光强度逐渐降低，表现出剂量依赖性效应。进一步分析显示DHQ浓度与细胞内荧光强度之间呈负相关，在100μM时观察到明显的保护作用。结果证实DHQ有效抑制细胞内ONOO-的产生，对ALF具有显着的保护作用。
ALF的诊断和治疗监测
先前的研究表明，LPS和D-GalN的结合会诱发肝脏炎症，促进氧化应激，最终导致ALF。受MBCOX体外成像结果的启发，建立了ALF小鼠模型，以评估MBCOX通过体内成像监测肝脏ONOO-水平动态变化的能力，以及评估DHQ的保肝功效。将小鼠分为五组：对照组、ALF组和DHQ治疗组（20、40和60mg/kg）。在15、30和45分钟时获取荧光信号。由于生理条件下ONOO-水平较低，因此在对照组中检测到最小的肝脏荧光。ALF组的肝脏荧光明显增强，并随着时间的推移逐渐增加，反映出炎症驱动的ONOO-产生过多。在DHQ处理组中，观察到荧光，但随着DHQ剂量的增加而逐渐减少，表明通过抑制炎症和氧化应激对ONOO-产生的剂量依赖性抑制。主要器官的离体成像进一步证实荧光信号主要位于肝脏，与体内结果一致，证明ONOO-成像中MB-COX的肝脏有效积累。H&E染色显示对照组结构完整，没有坏死或炎症浸润。ALF组肝细胞结构严重破坏、坏死、排列紊乱、广泛炎症浸润。在DHQ组中，随着剂量的增加，肝损伤逐渐减轻，并且在80mg/kg时，肝小叶结构和细胞形态与正常组织非常相似。血清生化分析显示，肝损伤的经典标志物丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）在对照组中保持在正常范围内，但在ALF组中急剧升高。DHQ治疗后，ALT和AST水平均以剂量依赖性方式降低，与体内成像结果一致。总而言之，这些发现确立了MB-COX作为实时监测体内ONOO-动力学的可靠工具，能够诊断ALF并定量评估DHQ介导的肝脏保护作用。
结论
我们开发了一种用于ONOO-检测的NIRF探针MB-COX，并成功地将其应用于LPS/D-GalN诱导的ALF。MB-COX呈现近红外发射特性，表现出对ONOO-的高选择性和灵敏度。利用MB-COX，DHQ的治疗效果可视化，证实了其减轻炎症反应和降低细胞内ONOO-水平的能力。与传统的生化标记物相比，MB-COX有助于ALF诊断的直接可视化，并能够对体内ONOO-上调进行实时成像。此外，进一步采用MB-COX评价DHQ的保肝作用，成像结果与血清生物标志物和组织学分析一致。
参考文献
Peroxynitrite-Activated near-Infrared Fluorogenic Probe for Diagnosisand Efficacy Assessment in Acute Liver Failure. Mengyue Liu, Wei Peng,Dandan Tang, Bishan Ye, Ruirui Zhai, Fei Wang, Heng Liu, Fabiao Yu, and Ziyi Cheng. Sens.Actuators. B 449 (2026) 139116.https://doi.org/10.1016/j.snb.2025.139116.
