内容提要
该研究首次报道了一类具有双光学可调位点的新型深近红外（deep-NIR）至近红外二区（NIR-II）半花菁荧光团（命名为 GL），通过氯取代花菁 / 半花菁杂交制备，发射波长覆盖800-950 nm，关键含 meso-Cl 和羟基 / 氨基基团可转化为两个不同反应位点；基于 GL-2 构建的双锁定探针GL-Cys，在低半胱氨酸（Cys）水平下 830 nm 发射增强，高浓度时 765 nm 信号升高，且能通过体内双通道比率成像，有效区分胰腺 / 乳腺癌模型及对应肿瘤铁死亡模型中的 Cys 水平，为多通道生物分析提供了通用荧光团平台。
GL深近红外NIR-II半菁荧光团的设计、合成及光物理性质
为了获得具有双光学可调位点的NIR-II荧光团的深近红外，我们试图将氯取代的菁氨酸与半菁氨酸杂交，产生一种新的荧光团具有氯和羟基/氨基光学可调基团的新型近红外染料。染料采用经典的半花青碱合成方法合成，收率较高。测定了GL-1-8在不同溶剂中的光物理性质，包括CH2Cl2，CH3OH，MeCN和MeCN/PBS (1:1 (v/v);pH值= 7.4) 与预期一致，GL-1-8染料在MeOH中的最大吸收峰分别在766、799、780、824、753、764、853和869 nm处。相应地，这些染料在深近红外和NIR-II区域也表现出较强的荧光，最大发射峰分别位于825、827、832、839、920、923、927和936 nm处。为了解不同供体和受体对光谱位移的影响提供理论依据，我们使用Gaussian 9软件包对GL-1-8的结构进行了优化和分析，并使用Multiwfn和VMD程序对结果进行了进一步处理。密度泛函理论(DFT)计算表明，GL-1-8的能隙从2.047 eV逐渐减小到1.759 eV，与实验光谱数据吻合较好。考虑到复杂多变的生物环境，氧化剂和亲核试剂会影响染料的稳定性，我们在MeCN/PBS (1:1 (v/v))中测试了GL-1-8对常见生物干扰物，即谷胱甘肽(GSH)、NaClO、Na2S和H2O2的抵抗能力。在所有条件下，GL-1-8的吸收光谱和荧光光谱基本保持不变，强烈表明GL-1-8在生理条件下具有良好的化学稳定性。不同pH条件下GL-1的发射光谱呈现出以l = 820-940 nm为中心的荧光带增加和以l = 740-860 nm为中心的荧光带减少。此外，吸收光谱也表现出ph诱导的波长偏移。
双锁紧探针GL-Cys的设计、合成及光物理性质研究
考虑到双光学可调位点在深近红外到NIR-II半氰基荧光团(GL)支架中的优异性能，使用GL-2作为支架，我们首次通过整合不同的胱氨酸反应位点(3,5-二(三氟甲基)苯乙醇和丙烯酰)构建了双锁探针GL-Cys，用于有效分化胰腺/乳腺肿瘤小鼠模型和相应的肿瘤铁垂模型中的Cys水平。为了研究GL-Cys区分检测Cys的可行性，我们评估了GL-Cys与Cys反应时吸收光谱的变化。当加入低浓度的Cys (0-60 mM)时，GL-Cys溶液在610 nm处的吸光度逐渐降低。随后，在810 nm和830 nm处分别出现了新的吸收带和新的发射带，溶液的颜色逐渐从蓝色向绿色转变。值得注意的是，过量Cys的加入导致吸收光谱从810 nm向645 nm发生了明显的蓝移。并伴有相应的颜色变化，由绿色变为青绿色。在60-350 mM的Cys浓度范围内，在765 nm处观察到荧光强度的逐渐增强。此外，GL-Cys对Cys的时间依赖性响应表明，在加入低浓度的Cys (60 mM)后，在100 s内达到平衡。这些结果表明，Cys通过迈克尔加成反应攻击GL-Cys的丙烯酸基，形成硫化物，分子内环化释放GL-OH。值得注意的是，GL-Cys的荧光强度与Cys浓度(0-10 mM)呈显著的线性相关。从荧光光谱来看，GL-Cys对Cys的检出限(3s/k)约为31.3 nM。此外，荧光光谱的动态变化表明，高浓度(350 mM)下，GL-Cys探针与Cys在25 min内完全反应。根据先前的报道，这种延长的反应时间归因于GL-Cys探针首先进行迈克尔加成反应以释放GL-OH。此外，GL-OH中的苯硫基是典型的亲核取代离去基，与荧光基团共价结合生成GL-OH-cys。这些能隙呈减小趋势，这也解释了吸收波长的变化。这些结果表明，双锁定探针GL-Cys对不同发射通道的低浓度和高浓度Cys都有效。
双锁荧光探针对肿瘤小鼠模型及相应肿瘤铁死亡模型中Cys水平双通道分化
为了验证探针在复杂生物基质中的适用性，我们进行了选择性实验来评估GL-Cys对各种活性物质的反应。通道1(lem= 830 nm)，只有Cys组诱导了7.8倍的荧光强度增加，而其他物质如活性硫/氧/氮、氨基酸、阳离子和阴离子等没有引起明显的荧光增强。同样，在通道2(lem= 765 nm)中，仅添加Cys即可使荧光强度增加12.7倍。这些结果表明，GL-Cys对Cys具有较高的选择性，适用于生物系统中特定的双通道Cys识别和高保真成像。
双锁定探针GL-Cys在不同细胞系的体外荧光成像
双锁定探针 GL-Cys 以 GL-2 荧光团为骨架，凭借低细胞毒性、线粒体靶向性及 Cys 浓度依赖性光谱响应特性，在 PANC-1（胰腺癌细胞）、4T1（乳腺癌细胞）、L929（正常细胞）等细胞系中实现了 Cys 水平的精准检测，尤其可监测肿瘤细胞铁死亡过程中 Cys 的动态变化，相关实验数据充分验证了其体外成像效能。利用商业线粒体荧光探针与 GL-Cys 共孵育 PANC-1 和 4T1 细胞，通过共聚焦成像观察到两者荧光信号高度重叠。该结果证明 GL-Cys 可特异性靶向线粒体 —— 作为细胞内 Cys 代谢及铁死亡相关活性氧产生的关键场所，其靶向性为精准监测线粒体局部 Cys 水平波动提供了空间定位基础，提升了成像的生物学意义。以 PANC-1（胰腺癌细胞）和 4T1（乳腺癌细胞）为核心研究对象，通过预处理调控细胞内 Cys 水平，验证 GL-Cys 的成像区分能力，空白对照组（仅 GL-Cys 孵育）：PANC-1 和 4T1 细胞内均出现明显红色荧光（对应 GL-Cys 与内源性 Cys 反应后的信号），证明肿瘤细胞内存在基础水平的 Cys，且 GL-Cys 可有效响应并发出荧光。Cys 耗竭组（NEM 预处理 + GL-Cys 孵育）：N - 乙基马来酰亚胺（NEM）是生物巯基特异性清除剂，可通过与 Cys 反应降低细胞内 Cys 浓度。实验显示，经 100 μM NEM 预处理 30 min 后，再加入 GL-Cys 孵育 30 min，PANC-1 和 4T1 细胞的红色荧光强度显著降低 —— 定量数据表明，两组细胞的相对荧光强度较空白对照组均下降约 50%-60%，直接证明 GL-Cys 的荧光信号与细胞内 Cys 水平呈正相关，可反映 Cys 的耗竭状态。Cys 补充组（NAC 预处理 + GL-Cys 孵育）：N - 乙酰 - L - 半胱氨酸（NAC）是常用的 Cys 供体，可通过细胞代谢转化为 Cys，升高胞内 Cys 浓度。经 100 μM NAC 预处理 30 min 后，PANC-1 和 4T1 细胞的红色荧光强度较空白对照组显著增强，相对荧光强度提升约 40%-50%，进一步验证了 GL-Cys 对细胞内 Cys 水平变化的灵敏响应，可准确区分 “低 Cys - 基础 Cys - 高 Cys” 三种状态。
体内双通道荧光成像可视化胰腺癌铁下垂期间的Cys水平
在胰腺癌（PANC-1 细胞构建皮下肿瘤模型）铁死亡期间 Cys 水平的体内双通道荧光成像研究中，先通过 H&E 染色验证双锁定探针 GL-Cys 对小鼠主要器官（心、肝、肺、脾、肾）无病理损伤，且探针注射后 70 min 内主要在肝脏积累并经肝胆途径有效清除，具备良好生物安全性与代谢特性；随后将实验小鼠分为 6 组（正常小鼠 + NEM+GL-Cys、正常小鼠 + GL-Cys、胰腺癌小鼠 + GL-Cys、胰腺癌小鼠 + NEM+GL-Cys、胰腺癌小鼠 + erastin+GL-Cys、胰腺癌小鼠 + erastin+Fer-1+GL-Cys），采用双通道成像（通道 1：λex=720 nm、λem=790 nm；通道 2：λex=690 nm、λem=750 nm）监测，结果显示：胰腺癌小鼠（组 3）通道 2 荧光强度从正常小鼠（组 2）的 0.52±0.02 升至 1.0±0.02，证明肿瘤中 Cys 水平显著更高，NEM 预处理（组 4）可使双通道信号降至正常水平；erastin 诱导铁死亡后（组 5），通道 2 荧光强度从 1.0±0.02 降至 0.65±0.03，通道 1 信号也轻微下降，且肿瘤组织中 Cys、GSH 水平降低、MDA（脂质过氧化标志物）升高 1.8 倍，证实铁死亡伴随 Cys 下调；而 Fer-1 抑制铁死亡后（组 6），双通道信号较组 5 回升；此外，通道 2 / 通道 1 荧光比值以胰腺癌组最高（约 5.45），铁死亡组显著降低（约 4.54），上述数据均表明 GL-Cys 可通过体内双通道荧光成像有效可视化胰腺癌铁死亡期间 Cys 水平的动态变化。
乳腺癌小鼠模型中探针GL-Cys的体内双通道成像
在乳腺癌（4T1 细胞构建皮下肿瘤模型）体内双通道成像研究中，将小鼠分为 4 组（乳腺癌小鼠 + GL-Cys、乳腺癌小鼠 + NEM+GL-Cys、乳腺癌小鼠 + erastin+GL-Cys、乳腺癌小鼠 + erastin+Fer-1+GL-Cys），采用双通道（通道 1：λex=720 nm、λem=790 nm；通道 2：λex=690 nm、λem=750 nm）成像监测，结果显示：与仅注射 GL-Cys 的乳腺癌组（组 1）相比，NEM 预处理组（组 2）双通道荧光强度在 0-30 min 内逐渐降低，证明 NEM 可耗竭 4T1 肿瘤内 Cys；erastin 诱导铁死亡组（组 3）双通道信号显著下降，通道 1 从 2.12±0.03 降至 1.25±0.02、通道 2 从 4.12±0.03 降至 2.75±0.02，表明铁死亡过程中 Cys 水平下调；而加 Fer-1 的铁死亡抑制组（组 4）双通道信号较组 3 明显回升；同时，通道 2 / 通道 1 荧光比值与 Cys 水平变化趋势一致，且肿瘤组织生化检测显示组 3 中 Cys、GSH 水平降低、MDA（脂质过氧化标志物）升高，进一步验证模型有效性。
结论
本研究成功地提出了一个新的深近红外到NIR-II半菁氨酸荧光团(GL)家族，具有双光学可调位点，用于开发双锁定探针。这些GL染料是通过氯代菁/半菁杂交得到的，其发射波长跨越800-950 nm。值得注意的是，这些染料整合了花青素和半花青素的光学可调位点，并且它们的光学性质可以通过中位氯(如花青素染料)和末端氨基/羟基(如半花青素染料)轻松调节，从而显著推进了双锁探针的发展。基于这些荧光团，我们开发了一种智能双锁探针GL-Cys，它在体外对Cys和Cys浓度依赖的光谱切换具有出色的响应性和选择性，在低Cys水平下增强830 nm发射，在高浓度下增加765 nm信号。更重要的是，通过体内双通道比例荧光成像，GL-Cys能够有效区分各种肿瘤模型及其相应的肿瘤铁垂模型中的Cys水平，强调了GL荧光载体作为多路生物分析的多功能平台的潜力。
参考文献
Deep-NIR to NIR-II hemicyanine fluorophore scaffolds with dual optically tunable sites for in vivo multiplexed imaging，Qinian Liu, Zhuoyang Li, Yujie Huang, Zhenni Lin, Xing-Can Shen * and Hua Chen *，Chem. Sci.，DOI: 10.1039/d5sc06690e
