内容摘要
我们开发了一种新型近红外荧光探针（3c），其以创新的硼二氟化物吲哚啉（BFI）为骨架，专门针对Aβ聚集体。该探针表现出显著的极性敏感荧光增强特性，以及出色的光学性能，包括近红外发射和186纳米的大斯托克斯位移，使其在Aβ聚集体检测方面具有卓越性能。体外实验表明，该探针与Aβ聚集体相互作用时，荧光开启比高达208倍。在APP/PS1转基因小鼠中，该探针能迅速穿透血脑屏障，并对Aβ斑块进行选择性标记，与野生型对照相比，对比度显著。
结果与讨论
探针的合成以及光物理性质研究
为构建专门针对Aβ1–42聚集体的D-π-A型近红外荧光探针，我们通过克诺文纳格尔缩合反应高效合成了探针1a–1b，反应中使用乙酸/哌啶作为添加剂，通过不同的π桥将硼二氟化物吲哚啉（BFI-1）电子受体与N，N-二甲基苯胺供体连接起来。为满足体内应用所需的水溶性要求，我们对羧酸衍生物BFI-2进行了两步聚乙二醇化修饰：首先在EDCI存在下用NHS活化形成NHS酯，然后与2-[2-（2-氨基乙氧基）乙氧基]乙醇连接，最终获得具有适当亲脂性的探针3a–3c。
光物理性质研究
所有探针在二氯甲烷（DCM）中均表现出541–573纳米范围内的强吸收带，摩尔消光系数在5.5至8.2×10⁴M⁻¹cm⁻¹之间；其中3a和3b的吸收能力最强(ε>8.0×10⁴M⁻¹cm⁻¹）。所有探针在二氯甲烷（DCM）中均在541–573纳米范围内表现出强吸收，摩尔消光系数为(5.5–8.2×10-4M−1cm−1)，其中3a和3b的吸收能力最强(ε>8.0×10-4M−1cm−1)。关于发射特性，这些探针通常表现出远红到近红外发射（632–759纳米），其中3c的发射波长最长（759纳米），而1b（743纳米）也表现出优异的近红外发射性能。值得注意的是，有几个探针具有较大的斯托克斯位移，特别是1b（187纳米）和3c（186纳米），其次是1a（153纳米）。这些较大的斯托克斯位移有助于减少激发光的干扰，从而在Aβ聚集体检测过程中提高信噪比。在Aβ聚集体的疏水微环境中，溶剂敏感的荧光增强效应实现了对阿尔茨海默病病理的高对比度检测。所有探针在低极性溶剂体系（四氢呋喃和二氯甲烷）中均表现出最强的荧光发射，在二氯甲烷中的荧光量子产率较高（范围为0.13至0.93）。在这些探针中，3c的溶剂依赖性荧光行为最为显著。其在水溶液中几乎不发光，而在四氢呋喃中的荧光强度是水溶液中的739倍。3c在二氯甲烷中的荧光量子产率（0.16）是水溶液中的160倍（<0.001），表明其光物理性质对溶剂极性高度敏感。随着溶剂极性的增加（从二氯甲烷到甲醇，再到50%四氢呋喃（四氢呋喃-水（5:5，体积比）），最后到水），探针3c的荧光强度急剧下降，同时发射波长出现明显的红移。这一特性表明探针3c能够在Aβ聚集体的疏水微环境中产生强烈的荧光信号，同时在水性介质中保持极低的背景干扰。计算预测得出各探针的ClogP值分别为：1a（6.41）、1b（6.94）、3a（4.56）、3b（4.24）和3c（4.89）。与同样具有长波长发射（>740纳米）和大斯托克斯位移的探针1b相比，探针3c（ClogP=4.89）显示出更有利于血脑屏障穿透的分配系数。
体外检测Aβ聚集体
我们系统地评估了探针（1a、1b、3a、3b、3c）和参考剂噻唑蓝（ThT）对Aβ1–42聚集体的响应性。在2分钟的短期结合实验中，荧光增强倍数分别为10.4（1a）、2.62（1b）、34.6（3a）、95.4（3b）和60.8（3c）倍。探针3b和3c的荧光增强效果显著优于噻唑蓝（44.8倍），其中3b的增强效果比噻唑蓝高2.1倍。我们进一步研究了探针3b和3c对Aβ1–42聚集体的检测性能。实验通过将固定浓度的探针（1μM）与不同浓度的Aβ1–42聚集体（3b：0–25μM；3c：0–40μM）在室温下共孵育，然后测量荧光强度来进行。结果表明，两种探针在Aβ1–42聚集体存在时均表现出显著的浓度依赖性荧光增强，其中探针3c与聚集体含量之间存在明显的定量关系。两种探针对Aβ1–42聚集体的检测限（LOD）均较低，分别为28nM（3b）和60nM（3c）。亲和力研究表明，化合物3b（Kd=0.48μM)）对Aβ1–42聚集体的结合亲和力略高于3c（Kd=0.87μM）。
利用3c进行活体和离体脑部成像
基于探针3c出色的光物理特性，包括近红外发射（λem=759纳米）、显著的溶剂响应性以及明确的TICT效应，再加上其在体外已证实的对Aβ聚集体具有高倍数（208倍）的特异性荧光增强效果和出色的特异性。在APP/PS1转基因小鼠（一种公认的阿尔茨海默病模型）体内对其成像性能进行评估。静脉给药后，3c表现出显著的血脑屏障通透性，在注射后5分钟内脑组织中即可检测到近红外荧光信号。定量分析显示，APP/PS1小鼠的荧光强度约为野生型对照组的两倍。时间进程监测显示信号逐渐增强，在180分钟时达到峰值，随后逐渐清除。这些综合发现表明化合物3c独特的快速穿透血脑屏障、在脑内有效蓄积以及在AD模型小鼠与野生型小鼠之间实现差异荧光可视化的能力。将化合物3c静脉注射入AD模型小鼠体内后，对脑组织切片进行荧光成像，结果显示3c成功标记了大脑皮质和海马区的Aβ斑块，并与市售的淀粉样蛋白染料（ThT）表现出良好的共定位。我们对脑组织切片进行了体外荧光染色和成像分析。结果表明，化合物3c能够有效地标记APP/PS1转基因小鼠大脑切片皮质和海马区域的Aβ斑块，并且与ThT标记的Aβ斑块有显著的共定位。定量共定位分析进一步证实了在两个脑区中3c信号与ThT信号之间存在高度的空间相关性。此外，3c与6E10抗体标记的Aβ斑块表现出良好的共定位，并且具有出色的信噪比，定量分析表明空间一致性良好。相比之下，在相同实验条件下，野生型对照小鼠的脑切片中未观察到可检测到的荧光信号。这些结果有力地证明了化合物3c对脑组织中Aβ斑块具有高度的选择性和结合特异性。
结论
本研究设计并合成了以N，N-二甲基苯胺为电子供体的一系列基于BFI的近红外荧光探针，用于检测阿尔茨海默病（AD）中的Aβ聚集体。我们采用分子转子策略设计探针，并通过π共轭桥修饰和亲水侧链引入对其进行系统优化。结构关系分析表明，探针3c对Aβ1–42聚集体检测具有良好的光学性能，包括高极性敏感性、近红外发射（λem=759纳米）和186纳米的大斯托克斯位移，在体外与Aβ1–42聚集体结合时荧光增强208倍。体内实验表明，3c在尾静脉注射后5分钟内即可迅速穿过血脑屏障，并特异性结合APP/PS1转基因小鼠的Aβ斑块，与野生型小鼠相比显示出显著的信号差异。
参考文献
Molecular Rotor-Based Near-Infrared Fluorescent Probes with Large Stokes Shift for Ultra-Fluorogenic Aβ and Alzheimer's Disease Imaging.Li Chen ,Yilin Xia , Baichuan Li , Jing Gao , Xiangyang Zhou , Xinde Li , Zhenghao Chen , Ying Liu , Wuyu Mao , Jifa Zhang * , Lei Chen .Sens. Actuators. B 449( 2026)139065. https://doi.org/10.1016/j.snb.2025.139065
