行业文献

内容提要

   本研究报告了一种独特的基于碳硫酸盐的触发器，利用级联环化反应来特异性检测H₂S_n。利用该策略制备了8个新的荧光探针(CTP 1-8)并进行了评价。CTP-8不仅能够对H₂S_n进行高灵敏度和选择性的检测，而且能够可视化H₂S_n在活细胞和小鼠体内的波动我们首次展示了胰岛素抵抗细胞和2型糖尿病(T2DM)小鼠内源性H₂S_n动态的荧光成像。这种基于碳硫酸盐的触发器也可以潜在地用于具有光学可调酚羟基的其他荧光染料支架。

结果与讨论

   考虑到H₂S_n既可以作为亲核试剂也可以作为亲电试剂，亲核性更强而不是生物硫醇或H₂S。利用这个特性，我们提出了一个新的探针模板I，它可以特定于H₂S_n。与之前报道针不同，我们利用不同的给电子基团来取代苯甲酰基中的苯环，从而显著降低羰基碳的亲电性。这种设计可以更有效地抑制探针与生物硫醇或H₂S之间的反应_。此外，我们推断，修改I中的X或R基团会显著影响其对H₂S_n的反应速率，同时也会调节探针的水溶性。如果H₂S_n可以选择性地与含有特殊X和R基团的触发器反应，则产生的中间体II将继续与H₂S_n(作为亲电试剂)反应生成III。随后的自发环化反应将释放酚类荧光团。因此，这种级联环化反应对H₂S_n具有敏感性和特异性。考虑到上述考虑，使用常见的酚类荧光团3-o-甲基荧光素(MF)制备了一个小探针库(CTP1-7)。采用不同的X和R基团考察了给电子基团对探针对H₂S_n反应速率的影响，多乙氧基链或季铵的引入可能会提高探针的水溶性。有了这些探针，我们首先研究了它们的光谱性质和对H₂S_n的响应。正如预期的那样，由于MF羟基的保护，这些探针几乎没有吸收，荧光发射可以忽略不计。除CTP-3外，用Na₂S₂水溶液(作为H₂S_n的来源)处理30分钟后。所有探针在452 nm和472 nm之间都表现出很强的吸收峰，512 nm处荧光强度显著增加。取代基(X为O, R为- CH3)比N, N-二甲基(X为N, R为- (CH3)2)更有效。CTP-3庞大的叔丁基可能会降低其对H₂S_n的反应性。此外，CTP-7比其他探针表现出更大的荧光增强，这表明季铵单元更有效地促进探针与H₂S_n之间的反应。CTP-7的伪一阶速率常数k′远高于CTP-2 (CTP-7的k′= 0.74 min⁻¹,CTP-2的k′= 0.089 min⁻¹)，后者在生物硫醇存在下表现出比CTP-7更好的稳定性。为了比较不同取代的硫酸盐触发基团对生物硫醇的稳定性和特异性，在生物硫醇和单质硫的混合物中测量了两种探针的荧光变化。同型半胱氨酸(Hcy)、半胱氨酸(Cys)或谷胱甘肽(GSH)单独诱导了对CTP-7的荧光一定程度的增加，而生物硫醇和S8的混合物则引起了反应。这可能是因为少量的CTP-7与生物硫醇反应形成中间体II，然后与S8反应释放荧光团。这些结果表明，季铵基团显著影响CTP-7酯键的稳定性，CTP-2与生物硫醇的相互作用可能性较小。在这些新型H2S_n探针中，CTP-2因其优异的传感性能而最有前途，因此被选中进行进一步的研究。为了评估CTP-2对H₂S_n的特异性，我们评估了它与各种生物相关物种的反应性。其中包括其他活性硫种(RSS)、活性氧种(ROS)、维生素C、代表性氨基酸、金属离子和酯酶。除了Na₂S₂外，这些分析物都没有引起任何显著的荧光变化。Na₂S₂的检出限为63 nM。由于H₂S可以由ClO⁻生成H₂S_n，CTP-2对Na₂S和ClO⁻的混合溶液也表现出强烈的荧光响应。

   这些发现证实了CTP-2对H₂S_n的高特异性和敏感性。为了进一步验证碳酸盐基触发器在其他具有光学可调酚羟基的荧光团中的适用性，使用与CTP-2相同的触发策略合成了一种新的近红外(NIR)探针CTP-8。该探针采用了广泛使用的NIR双氰异硫酮荧光团，旨在通过更深的组织穿透和减少背景荧光干扰，实现H₂S_n的高灵敏度检测。随后，测定了CTP-8对H₂S_n的体外光谱响应_。CTP-8在394 nm处有很强的吸收峰，几乎没有荧光，但加入Na₂S₂后，在394 nm处有很强的吸收峰。539 nm和688 nm处有明显的NIR发射。在100µM Na₂S₂溶液中，1 h后荧光强度增加了约146倍，伪一阶速率常数为0.045 min⁻¹。CTP-2和CTP-8的响应时间差异源于它们各自荧光团的基本结构特性，这些特性本质上调节了级联环化动力学。CTP-8在羰基附近结合了一个更具空间阻碍的共轭芳香环体系，为H₂S_n的亲核攻击创造了空间屏障。这种位阻减缓了级联环化，导致相对于CTP-2的响应时间更长。此外，CTP-8的NIR荧光团与CTP-2的荧光团MF具有明显不同的疏水性和聚集倾向，这可能进一步导致响应时间的差异。Na₂S₂的检出限为115 nM。此外，CTP_-8与各种干扰生物分子孵育，荧光强度没有明显增加，表明其对H₂S_n具有较高的特异性和敏感性。为了阐明CTP-2或CTP-8对H2S_n的反应机理，我们研究了苯基2-(甲氧羰基)硫代)苯甲酸酯与Na₂S₂在THF/PBS混合溶液(pH 7.4, 1:1 v/v)中的反应。正如预期的那样，苯二噻吩酮和苯酚被成功分离，产率适中(61%)。在证实了CTP-2或CTP-8在体外对H₂S_n的高特异性和敏感性后，我们现在感兴趣的是这些探针是否可以用于监测活细胞和体内H2S_n的波动。2型糖尿病(T2DM)是一种以胰岛素抵抗升高和胰岛素分泌受损为特征的多因素疾病导致胰岛素抵抗的主要机制是PI3K/AKT通路的损伤，这是由ROS水平升高引发的一方面，既往研究表明，H₂S可以调节胰岛素靶器官的胰岛素敏感性，糖尿病小鼠体内H₂S水平升高鉴于H₂S和ROS之间的相互作用是体内合成H₂S_n的重要途径，我们的目标是了解T2DM进展过程中H₂S_n的波动。

   HepG2细胞和RAW 264.7细胞分别进行不同的预处理30 min，然后用5µ M探针CTP-2或CTP-8再孵育30 min。我们发现，在Na₂S处理或NaClO处理的细胞中，只观察到非常弱的荧光，然而，当Na₂S 和NaClO一起施用时，观察到明显的荧光增强，这是由于H₂S和ClO^-原位生成H₂S_n。CTP-2和CTP-8的细胞毒性可以忽略不计。两种探针在HepG2和RAW264.7细胞裂解液中也表现出12小时以上的优异稳定性，背景荧光没有明显增加。这些结果表明，CTP-2和CTP-8具有良好的细胞通透性，可用于检测活细胞中的外源性H₂Sn，虽然这些探针可以检测活细胞中的外源性H₂Sn，但我们选择CTP-8进行进一步的实验，因为它对H₂Sn 具有敏感的NIR荧光响应，使我们能够研究活细胞和小鼠中的内源性H₂Sn 。脂多糖(LPS)可以诱导CSE mRNA过表达，从而促进内源性H₂Sn的产生。因此，LPS刺激RAW264.7细胞产 生内源性H₂Sn ，然后与CTP-8孵育。正如预期的那样，与对照细胞相比，LPS刺激细胞检测到明显的荧光增强。然而，当细胞用CSE抑制剂丙基甘氨酸(PAG)预处理时，LPS刺激导致荧光强度明显降低。此外，既往研究表明，葡萄糖胺(GlcN)可诱导HepG2细胞胰岛素抵抗梓醇通过激活活化蛋白激酶(AMPK)抑制ROS过量产生然后对HepG2细胞进行不同的预处理，然后用5µM CTP-8孵育30 min。处理的细胞荧光明显增强，表明胰岛素抵抗细胞中H₂S_n水平可能升高。相比之下，与GlcN组相比，梓醇处理显著降低了荧光，这表明梓醇减轻了胰岛素抵抗，并可能降低了H₂S_n水平。这可能是真的，因为内源性H₂S_n的产生部分是由H2S和ROS之间的反应驱动的，而梓醇介导的ROS还原可能会破坏这一途径。这些结果表明，虽然CTP-8与Na2S2的体外反应需要60 min以上的时间。

   我们随后在T2DM小鼠中进行了CTP-8的体内成像。主要器官的组织学分析显示，CTP-8具有良好的生物相容性。经尾静脉给药CTP-8后，监测各时间点荧光信号。与正常小鼠相比，T2DM小鼠的NIR荧光逐渐增加，并在注射后3小时达到峰值，随后在剩余成像期间缓慢下降。这种时间模式表明，H₂S_n水平可能在峰值阶段上调。在解剖和离体器官成像后，发现最强烈的荧光主要来自肝脏和肾脏。此外，作为已知的糖尿病治疗剂，梓醇可以改善胰岛素抵抗，降低血糖水平。评估梓醇治疗糖尿病期间H₂S_n水平的波动，我们在成像前通过连续四周的管饲给药给糖尿病小鼠。结果显示，与未处理的T2DM小鼠相比，梓醇处理导致荧光强度显著降低，表明梓醇可能是H₂S_n水平降低的原因。离体器官成像持了这些发现，与未治疗的T2DM组相比，梓梓醇治疗小鼠肝脏和肾脏的荧光信号明显减少。这些结果表明，CTP-8在H₂S_n的体内可视化方面具有很大的潜力。

结论

   我们已经提出了一种新的基于碳硫酸盐的触发器，它利用级联环化反应来实现H₂S_n的高灵敏度和特异性检测。利用这一创新策略，我们开发了一种H₂S_n特异性NIR荧光探针CTP-8，它不仅可以高灵敏度检测H₂S_n，还可以在活细胞和体内对H₂S_n进行定量成像。值得注意的是，我们报告了胰岛素抵抗细胞和T2DM小鼠模型中内源性H₂S_n动力学的首次可视化。这一关于H₂S_n行为的新见解突出了其在代谢失调中的可能作用，并对代谢疾病研究具有深远的意义。此外，由于这种基于碳硫酸盐的触发器可能适用于其他具有光学可调酚羟基的荧光染料支架，我们设想该研究为推进H₂S_n生物学研究和指导未来探针开发提供了有价值的工具。

参考文献

Carbonothioate-Triggered Cascade Cyclization Enables High-Specificity Fluorescence Imaging of Hydrogen Polysulfides. Jie Zhang, Meng He, Minrong Huang, Le Liu, Yuxin He, Deming He, Feiyi Wang, and Wei Chen*，Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e202519021，doi.org/10.1002/anie.202519021