内容提要
实时监测线粒体和核仁的动态和异质性对于全面了解细胞稳态和病理机制至关重要。目前的方法主要受到两个主要限制：活细胞中核孔复合物（NPC）的渗透性有限和基于强度的检测方法容易受到细胞微环境干扰的影响。 为了克服这些挑战，通过策略性地调整电子供体和接受部分之间的 π 共轭，开发了具有高光稳定性的红色发射荧光探针（DSM）。SM与RNA 和蛋白质结合后，可以选择性地在线粒体和核仁中积累，并具有可区分的平均荧光寿命，这使得它们能够通过荧光寿命成像显微镜 (FLIM) 动态可视化氧化应激期间的形态变化和相互作用。
结果与讨论
分子设计合成和光物理性质研究
D−π−A类分子由π桥连接的D和A单元组成，可以被广泛修饰以获得良好的光物理性质，用于细胞过程的实时成像。通过将N，N-二甲氨基苯基(D)与带正电的吡啶盐(A，这将赋予带负电荷的 RNA 具有高亲和力）结合，设计了三种 D−π−A 探针（DM、DSM 和 DSSM）。为了研究π桥长度和类型对该D−π−A框架内电子能级的影响，将一或两个噻吩单元顺序插入到共轭的C=C连接体中，从而能够精细控制分子畸变和共轭长度。 此外，结合转子状结构元件和靶向基序可以调节探针的亲脂性和亲电性特征，从而实现精确的亚细胞定位和对局部微环境变化的敏感性。 DM、DSM 和 DSSM 通过 Suzuki 偶联和 Knoevenagel 缩合反应合成. 通过紫外可见吸收光谱和荧光光谱系统地研究了DM、DSM和DSSM的光物理性质。它们分别在约450、460和470 nm处表现出逐渐红移的吸收最大值，但在水溶液中荧光发射较弱，不利于生物成像。 令人鼓舞的是，具有单个噻吩单元的 DSM 显示出 286 nm 的超大斯托克斯位移，这使得光谱串扰最小化，从而有效抑制生物自发荧光的干扰。 此外，浓度依赖性吸收光谱显示所有三种探针都具有较大的摩尔消光系数 (ε × 104) 和卓越的光子捕获能力。 然后，对基态和激发态进行瞬态密度泛函理论（TD-DFT）计算，以阐明其潜在的光电机制。 图S11显示DM、DSM和DSSM的最高占据分子轨道-最低未占据分子轨道(HOMO-LUMO)能隙(Eg)分别为2.68、2.53和2.51 eV，这与光谱实验观察结果一致。
RNA 和蛋白质结合能力
RNA 以单螺旋形式组装成核苷酸链，主要存在于线粒体和核仁中。鉴于带正电的荧光团很容易通过静电相互作用与带负电的 RNA结合，首先通过光谱仪器评估了 DM、DSM 和 DSSM 对 RNA 的一系列荧光响应实验。在460 nm光激发下，随着RNA滴定从0到30 μL，DSM（10 μM）在520 nm附近的荧光信号比DM（5倍）和DSSM（6倍）增加最多（8倍），表明RNA对DSM的亲和力最强。 然后，计算 RNA 浓度和荧光强度之间的线性关系，检测下限 (LOD) 为 2.15 μg/mL。 此外，还进行了探针和牛血清白蛋白（BSA）之间的荧光滴定实验，因为该蛋白质通常是线粒体的另一个重要组成部分。 在相同的激发条件下，只有当 DSM（10 μM）与 BSA（0 至 30 μL）混合时，才能在 660 nm 左右获得类似的荧光响应，在此期间测得的 LOD 为 2.09 μg/mL，远小于报道的指标。
线粒体和核仁靶向研究
为了研究 DSM 的亚细胞定位，在 DSM 处理的 HepG2 细胞中进行了 CLSM。在460 nm激发下，荧光发射可以在以下两个通道中收集：绿色通道（500−600 nm）和红色通道（600−700 nm），它们分别与DSM对RNA和BSA的体外光谱响应很好地对齐。在绿色通道中观察到围绕细胞外围的丝状结构和细胞核内的球形结构，而红色通道表现出的荧光主要局限于外围丝状结构。合并图像显示细胞质丝状区域有明显重叠的黄色荧光。 鉴于不同亚细胞器的不同微环境，FLIM 用于提供进一步的洞察并根据平均寿命差异区分这些亚细胞器。在相同的激发下，通过指数拟合获得伪彩色图像，通过 FLIM 显示两个不同的区域。主要位于细胞质的一个区域（感兴趣区域，ROI I）的平均寿命约为 1.197 ns，介于 DSM 结合 RNA（τavg = 2.277 ns）和体外蛋白质（τavg = 0.907 ns）观察到的寿命之间。 第二个区域主要分布在核区域（ROI II），显示出明显更长的寿命，约为 2.259 ns，与 RNA 结合时 DSM 的荧光寿命非常匹配（τavg = 2.277 ns）。使用市售的细胞器特异性染料进行了一系列共定位实验，包括 Mito-Tracker Deep Red（用于线粒体）和 Syto 9（用于核酸/核仁）。 以短波长发射通道为例，球形结构的绿色荧光与Syto 9的红色荧光紧密重叠。同时，丝状绿色结构与Mito-Tracker Deep Red表现出强烈的共定位。 这些结果共同证明 DSM 能够同时可视化活细胞内的线粒体和核仁。
长时间荧光成像的超光稳定DSM
在连续光照射下用DSM标记的HepG2细胞分别通过CLSM和FLIM成像。 连续采集 50 帧后，DSM 的荧光强度下降了不到 10%，表明其具有出色的抗光漂白能力。 这一观察结果也得到了体外光稳定性测定的支持，其中 DSM 在水溶液中的吸光度降解率在连续光照下保持最小。 此外，使用标准 MTT 测定的细胞暗细胞毒性测试显示对细胞活力的影响可以忽略不计，证实了其对于活细胞成像应用的生物相容性。 图中的 FLIM 分析显示，在选定的感兴趣区域内，线粒体 (τavg = 1.219−1.232 ns) 和核仁 (τavg = 2.183−2.251 ns) 的荧光寿命和形态仅有微小波动，表明 DSM 在长时间观察期间不会扰乱细胞稳态。 此外，为了评估潜在的光毒性，计算了 DSM 的单线态-三线态能隙 (ΔEst)。 获得了 1.59 eV 的相对较大的 ΔEst 值，表明光激发下活性氧（ROS）生成的概率较低，这是最大限度减少成像过程中光损伤的重要因素。
线粒体和核仁动态变化的实时 FLIM 成像
为了深入了解线粒体和核仁如何调节细胞生长和分裂，采用DSM研究生理条件下线粒体和核仁的动态变化。 用 DSM 染色 20 分钟后，立即进行 FLIM 成像观察 HepG2 细胞。 线粒体（τavg = 1.211 ns）和核仁（τavg = 2.249 ns）内不同的荧光寿命归因于它们不同的微环境和功能。 此外，DSM 还能够根据形态特征实现细胞伪足的可视化。 选定感兴趣区域（ROI-1 和 ROI-2）的延时成像揭示了微妙的寿命变化和显着的形态动态，特别是线粒体。 例如，在 ROI-1 中，时间分辨序列捕获了线粒体裂变和融合的完整周期。 最初，在前 18 秒内（① → ②），一个细长的线粒体（~2.5 μm）发生裂变，形成两个较小的线粒体（分别为~1.7 和~0.8 μm）。 在接下来的~24秒（③→④，42秒）中，这些碎片表现出快速的移动性，最终导致融合事件，重新形成丝状线粒体（~2.5μm）。 有趣的是，长时间观察（⑤→⑥），在78秒时揭示了随后的形态转变，先前融合的线粒体变得两侧缩进，并最终再次分裂成两个不对称的线粒体片段（⑦→⑧，在114秒时）。 裂变和融合事件的持续时间各约为 30 秒，表明正常生理条件下存在动态且平衡的线粒体重塑过程。在 ROI-2 区域内实时观察动态线粒体过程。选定的线粒体在大约2分钟内表现出连续的“Run−KISS−Run−KISS−和−Run”序列（①−⑧），反映了线粒体网络的动态重塑。 这一现象与之前关于线粒体动力学的报道相吻合，在此过程中会发生一系列生命活动，如受损线粒体的去除、ATP合成效率的调节、线粒体合成效率的恢复以及线粒体功能的恢复。与线粒体快速变化的形态形成鲜明对比的是，以较长荧光寿命为特征的核仁区在室温下相同的观察时间内，其位置和形状基本上保持静止。 这种稳定性表明，在正常细胞条件下，核仁以相对静止的状态存在。 总的来说，这些发现凸显了 FLIM 在线粒体和核苷酸动态实时可视化方面的实用性，为细胞代谢、生物能量学和应激适应机制提供了宝贵的见解。
结论
具有特定RNA和蛋白质靶向能力的荧光生物探针DSM可以很容易地穿透NPCs，同时对线粒体和核仁进行成像。令人振奋的是，DSM表现出了理想的性能的优越组合，包括灵敏的荧光响应、大斯托克斯位移 (286 nm)、优异的光稳定性和低细胞毒性。它可以通过 FLIM 实时可视化和跟踪特定生理和病理情况下线粒体和核仁的动态形态变化和异质性。 具体来说，在正常生理条件下，DSM可以动态监测线粒体的裂变和融合，指示细胞生命活动。
参考文献
Real-Time Monitoring of the Dynamics and Heterogeneity for Mitochondria and Nucleoli with a Superphotostable Fluorescent Probe by Fluorescence Lifetime Microscopy, Qiuhao Xu, Yanxin Wang, Yingyu Zhu, Tan Wang, Yuan Rao, Xiaoping Gan, Yingcui Bu， ACS Sens,2025, 10, 6938-6949，https://doi.org/10.1021/acssensors.5c01961
