内容提要
我们开发了NKH NIR-CHOL，一种具有与逻辑响应的胆固醇锚定的近红外-II(−-II)探针，通过同步靶向富含脂质的微环境和检测斑块易损性生物标志物来应对早期动脉粥样硬化(AS)检测的关键挑战。这种三重响应剂利用胆固醇锚定进行精确定位，同时通过髓过氧化物酶活性检测来自脂滴积累和次氯酸(HClO)过度表达的粘度/极性变化。具有D-π-A结构荧光团的NKH−Chol仅在粘度/极性扰动与HClO共存时显著激活，产生超低本底的近红外-II发射(＞1000 nm)。在AS小鼠模型中，它实现了高对比度动脉斑块成像。
结果和讨论
NKH−胆碱探头的设计与表征
我们设计并合成了一种新型的D-π-A结构不对称花菁荧光探针NKH。该探针是通过苯甲醛的苯甲醛衍生物(电子供体，D)和α-硫代吡喃菁衍生物(电子受体，A)的Knovenagel缩合反应合成的。在分子结构中，D单元和A单元通过刚性共轭双键(π-桥)相连，形成一个高度离域的电子体系。这种独特的结构设计使探头具有几个显著的特点。N，N-二甲基硫代氨基甲酰基作为一种特异的识别单元，对HClO具有很高的选择性和灵敏度。此外，扭曲的分子内电荷转移(TICT)过程使探头能够对粘度变化做出反应。强烈的分子内电荷转移(ICT)效应使该探针对微环境极性的变化高度敏感。荧光研究揭示了与逻辑门控响应曲线：单个刺激(HClO、高粘度或低极性)下的最小发射强度，但当所有三个条件同时满足时，荧光显著增强。为了提高靶向性，我们通过铜催化的叠氮化物−炔环加成反应将胆固醇连接到NKH上，得到了优化的NKH−胆碱探针。UV-Vis吸收光谱和荧光发射光谱分别在690 nm和1030 nm处出现最大吸收峰，斯托克斯位移为340 nm，有效地减少了自吸收和自猝灭现象。然后，我们表征了HClO引起的光谱变化，观察到在690 nm处吸收减弱，并在725 nm处出现新的峰，证实了特定的探针-氧化剂相互作用。荧光分析显示，在1030 nm处的发射增强与浓度有关，荧光增强5.7倍。这一反应源于HClO介导的N，N-二甲基二硫代氨基甲酸酯部分的氧化裂解，生成可增强分子内电荷转移(ICT)效率的羟基取代衍生物(NKOH−CHOL)。该探针具有出色的定量检测能力，对HClO浓度在0至90μM(R2=0.9789)范围内呈线性响应，检测下限非常低，为0.48μM(按3σ/k方法计算)。测得的−胆固醇的量子产率为0.038%，进一步证实了在动脉粥样硬化环境中检测HClO的高灵敏度。高效液相色谱-质谱仪(HPLC-MS)明确地证实了羟基取代产物是通过HClO介导的氧化裂解形成的。该探针对HClO表现出卓越的选择性，当10μM NKH−Chol用90μM HClO处理时，荧光增强了3.4倍。这种反应表现出特殊的特异性，因为各种与生物相关的干扰物种产生的信号变化可以忽略不计，证实了该探针对复杂生物基质中的HClO检测具有良好的分辨能力。此外，动力学分析显示了快速的响应曲线，在300 S内实现了完整的信号发展，这突显了该探针在实时监测生物系统中HClO动态的强大潜力。
我们对NKH−胆固醇在甘油−水体系中的系统研究揭示了显着的粘度依赖的光物理性质。随着甘油含量的增加(高达80%)，吸收光谱逐渐红移，并在920 nm处出现新的吸收带，表明电子跃迁受到显著的粘度调节。最值得注意的是，荧光研究显示，在高粘度环境(95%甘油)中，荧光发射显著增强7.3%，蓝移，我们将其归因于有效抑制扭曲的分子内电荷转移(TICT)过程。量子产额测量定量证实了这种增强，显示从纯水中的0.008%逐渐增加到60%甘油溶液中的0.044%。在较宽的粘度范围内(10−95%甘油)，粘度响应与FöRster−Hoffmann方程(R2=0.9734)有很好的相关性，显示出可靠的定量传感能力。
NKH−CHOL的全面极性响应分析显示，它在不同的溶剂环境中表现出特殊的溶致变色行为。该探针具有显著的极性依赖光学性质，表现出70 nm的红移(980-1050 nm)，并伴随着荧光猝灭，随着溶剂极性的增加，从甲苯到DMSO。在精确控制的1，4-二氧六环-水体系(Δf=0.022−0.320)中，最大吸收峰随极性的增加而红移30 nm(660−690 nm)。最引人注目的是，荧光强度在低极性条件下显著增强7.7倍，Lippert−Mataga分析证实发射强度与溶剂极性参数Δf之间具有良好的线性相关性(R2=0.9612)。在纯1，4-二氧六环中的量子产率达到了非凡的0.110%，超过大多数已报道的NIR-II有机小分子，同时在90%的1，4-二氧六环溶液中保持出色的光稳定性。
NKH-−胆固醇与逻辑反应能力的体外检测
我们对NKH−CHOL的二元刺激系统进行了研究。在这些系统中，探头显示了信号放大能力。基于动脉粥样硬化病理环境的参数特征，我们建立了广泛的组合测试的刺激条件。通过将不同浓度的HClO(0，30，60，90μM)与不同体积分数的甘油(0%，30%，60%，90%)相结合，构建二元刺激系统，系统地评价探针的响应行为。结果表明，双因素组合显著增强了探针的荧光强度，且这种增强随着单个因素(HClO浓度或甘油体积分数)的变化呈现出趋势。同样，由HClO和1，4-二氧六环组成的二元体系也显示出类似的协同响应效应。
NKH−胆汁探针的细胞成像
我们系统地评估了胆固醇修饰探针(NKH−CHOL)的靶向性能及其对动脉粥样硬化(AS)微环境的响应。在这项研究之前，我们证实了NKH−CHOL具有良好的细胞生物相容性。我们用氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞形成泡沫细胞，该细胞具有高活性氧基(ROS)水平、高粘度和低极性微环境。我们使用ROS检测试剂DCFH-DA和脂滴染色试剂盒(LD Tracker，BODIPY493/503)检测模型细胞。结果显示，氧化低密度脂蛋白处理的细胞DCFH和LD追踪器的荧光信号显著增强，表明细胞内的活性氧水平升高，脂质大量积累，证实了泡沫细胞模型的成功构建。然后，将NKH−CHOL(10μM)和非靶向NKH(10μM)分别与正常细胞或泡沫细胞孵育3h，并用实时成像仪进行分析。实验结果表明，与NKH相比，NKH−CHOL在氧化低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞中的荧光信号显著增强，证实了胆固醇单元可以有效地提高探针对泡沫细胞的靶向能力。此外，泡沫细胞对−胆固醇的摄取效率显著高于正常细胞，其荧光强度是正常细胞的5.6倍，这是由于泡沫细胞特有的HClO水平升高、粘度增加和极性降低所致。细胞水平的结果表明，NKH−CHOL可以区分泡沫细胞和正常细胞，这对于准确识别动脉粥样硬化斑块是必不可少的。
我们通过构建四个不同的病理细胞模型，严格验证了NKH−CHOL特异性识别动脉粥样硬化(AS)的多种病理特征的能力：(i)氧化低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞(模拟动脉粥样硬化斑块核心微环境)，(ii)脂多糖激活的M1巨噬细胞(模拟ROS和粘度升高的炎症)，(iii)制霉菌素处理的高粘度细胞，和(iv)油酸诱导的脂滴聚集细胞。荧光反应模式显示出显著的特异性：在氧化低密度脂蛋白和脂多糖刺激组中，该探针表现出浓度依赖性的信号增强，这种增强可被N-乙酰-L半胱氨酸(NAc，ROS抑制剂)显著抑制。同时，对RAW 264.7巨噬细胞进行了不同浓度的外源性给予，结果显示随着浓度的增加，荧光强度呈剂量依赖性的增强。相比之下，NAC的加入导致荧光信号显著减少，明确表明其对氧化应激的特异性反应。重要的是，该探针对不同的病理刺激表现出不同的激活模式，制霉菌素诱导的粘度增加产生了剂量−响应曲线之后4.1%的特征荧光增强，而油酸处理导致与脂滴积累相关的信号增加2.1倍。然后，我们通过在原始的264.7巨噬细胞中加入不同体积分数的二甲基亚砜来降低细胞的极性环境。结果表明，随着DMSO浓度的增加(体系极性逐渐降低)，探针的荧光强度也相应增强。
NKH−Chol在动脉粥样硬化的活体成像中的应用
为了验证NKH−CHOL在体内的诊断潜力，我们对载脂蛋白E缺陷(ApoE−/−)小鼠进行了系统的成像研究，这是动脉粥样硬化研究的金标准模型。经过16周的高脂饮食诱导和准备颈毛去除后，实时荧光成像显示非常有效的斑块靶向：静脉注射NKH−CHOL导致斑块在注射后30分钟内迅速聚集，在6小时达到峰值荧光强度。这种快速的靶向动力学，加上持续的信号保留，证明了该探针在识别生命系统中的动脉粥样硬化病变方面的非凡能力。
我们的体内比较研究表明，NKH−CHOL在动脉粥样硬化(ApoE−/−)小鼠和健康小鼠(C57BL/6J)的系统评价中具有更好的靶向性。高脂饮食诱导16周后，静脉注射NKH−CHOL和未修饰的NKH，进行全面的生物分布分析。采集的主动脉和主要器官的体外成像显示，虽然两种探针都显示通过网状内皮和泌尿系统的非特异性分布，但NKH−CHOL在动脉粥样硬化斑块中的特异性摄取比NKH(****p＜0.001，n=3)高1.92倍。最值得注意的是，NKH−Chol实现了异常的病变与正常动脉信号比6：1(****p＜0.001，n=3)。这应该通过两种协同机制来调节：(i)通过胆固醇部分介导的清道夫受体结合和低密度脂蛋白内化途径的主动靶向；(ii)由升高的HClO、增加的粘度和降低的斑块的极性特征的独特组合所触发的微环境响应激活。
通过对体外器官和主动脉荧光强度的定量分析，我们观察到心脏、脾、肺和肾脏的荧光强度很小，可以忽略不计。肝脏作为主要代谢器官，在体循环过程中表现出一定程度的探针滞留。相比之下，病变区域的荧光强度明显高于其他组织，是肝脏的1.3倍。这种增强主要归因于仅有探针的动脉粥样硬化病变的靶向能力和诊断特异性，提供了氧化应激和代谢变化的完整组合，满足与门激活机制，从而使荧光信号得以充分放大。这种双重靶向和激活策略与传统探针相比是一个重大进步，因为它同时提高了斑块积累的特异性和信号识别的准确性。
总结
NKH−CHOL代表了动脉粥样硬化治疗学中的一项革命性进展，将胆固醇介导的主动靶向与复杂的门控反应系统相结合，该系统可以同时检测三个标志性的病理特征：HClO爆发、粘度增加和脂质驱动的极性移动。尽管NKH−CHOL的量子产率不高，但由于其近红外II发射和病理微环境的特异性激活，使其能够进行高对比度的动脉粥样硬化成像，确保了强信号和最低背景。
参考文献
Cholesterol-Anchored AND-Logic NIR-II Probe for Triple-Responsive Atherosclerosis Imaging，Qing-Qing Ye,Han Zhu,Liang Zhao,Ren-Tang Huang,Yao Cheng,Meng-Die Zhu,Qing Zhang,Dai-Wen Pang,Zhi-Gang Wang,and Shu-Lin Liu，Anal.Chem.2025,97,21113-21124，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c04470
