内容提要
在超低激光功率密度下实现光热治疗(PTT)对于最小化光损伤和允许更高的最大允许皮肤暴露至关重要。然而，这要求光热剂不仅要具有优异的光热转换效率(PCE)，还要具有优异的近红外(NIR)吸收率。J聚集体红移明显，吸收峰窄，消光系数高。然而，通过分子设计实现可预测的J聚集体仍然是一个挑战。在本研究中，我们通过控制芳香环融合的aza-BODIPY染料的分子表面静电势，通过调节π共轭分子平面间的静电相互作用，成功地诱导了理想的J聚集。通过控制将染料包封到F-127聚合物中的制备方法，我们能够选择性地分别生成H-/ J-聚集体。此外，J-聚集体表现出两种可控的形态:纳米球和纳米线。重要的是，短波红外J聚集纳米粒子在0.27 Wcm-2 (915 nm)的超低功率密度下，PCE达到72.9%，有效地破坏了癌细胞和小鼠肿瘤。
结果与讨论
BDP-a和BDP-b的合成与光物理性质研究
设计了带8个或6个外周甲氧基的BDP-a和BDP-b，同时也得到了不带取代甲氧基的相应对照化合物BDP-c进行比较。BDP-a的单晶(CSD-IROSOZ)表明，BDP-a中Pb和Pc之间新形成的C - C键长度为1.478 Å。[观察到平面菲基团，Pa苯基与茚二烯平面之间的二面角分别为55.2°和44.1°。更重要的是，BDP-a表现出有序的反平行叠加，滑移角分别为38.4°和42.2°。每个分子骨架的外围以垂直距离3.59 ~ 3.62 Å重叠。这些数值完全符合j型激子耦合模型(滑移角θ <54.7°)。BDP-a在各种溶剂中均表现出尖锐的吸收峰，其在CHCl3中的最大吸收位于802 nm处，摩尔消光系数(r)高达1.72×105 M-1 cm-1，可归因于S0-S1跃迁。
由于甲氧基(对取代)的给电子能力，BDP-b在CHCl3中的最大峰红移至812 nm。BDP-b在氯仿中的吸收峰呈较宽的形状，在短波长处有两个肩峰，与BDP-a不同。TD-DFT计算表明，该波段主要来源于S0-S1、S0-S2和S0-S3的混合跃迁，这就解释了其相对较宽的带宽。BDP-a和BDP-b的荧光发射带分别以817 nm和842 nm为中心。值得注意的是，BDP-a在多种溶剂中表现出显著的荧光量子产率，特别是在甲苯中，其荧光量子产率达到11.0%。
当正己烷(一种较差的溶剂)加入到CHCl3溶液中时，BDP-a在802 nm处的吸收峰减弱，而在972 nm处出现窄吸收带，ɛ (2.50×105 M-1 cm-1)大大增强，表明BDP-a形成了高度有序的J-聚团。在最大吸收带(FW2/3 M)的2/3处，聚集体的全带宽为214 cm-1，比单体(434 cm-1)窄。根据吸收光谱，估计聚集体中相干畴的大小大约由4个单体组成。也观察到BDP-b的类似现象:当正己烷的比例增加到95%时，BDP-b的最大吸收峰红移至925 nm，而FW2/3M从单体的671 cm-1明显收窄至373 cm-1，对应于J-聚集体中约3个单体的相干长度。计算的BDP-a/BDP-b的跃迁偶极矩从单体的约5.52/4.96 D增加到J-聚集体的6.98/5.48 D。表明聚集的染料分子之间存在强烈的分子间激子耦合。
BDP-a和BDP-b的聚集态研究
随着正己烷比例的增加，BDP-a在972 nm处出现了一个新的发射带， Stokes位移从15 nm减小到只有4 nm，这也是J聚集体的特征。同样，BDP-b J-聚集体在939 nm处显示出最大发射，导致单体的Stokes位移从30 nm减小到J-聚集体的14 nm。此外，在正己烷/CHCl3混合物中，通过增加其浓度，也观察到环熔BODIPYs从单体逐渐转化为Jaggregates。例如，当BDP-a浓度达到2.5 μM时，J-聚集体的消光系数达到2.96×105 M-1 cm-1，证实了J-聚集体的浓度依赖性生长。此外，随着J-团聚体的生长，单体的荧光量子产率逐渐降低，团聚体逐渐增加，这也是J-团聚体的特征。
为了进一步研究BDP-a和BDP-b的聚集过程，在甲苯/正辛烷(7∶93,v/v)的高沸点溶剂中进行了温度依赖吸收光谱研究。J-聚集体在273 K(0°C)下制备，然后逐渐升温至358 K(85°C)或370 K(97°C)。在高温下，观察到J-骨料完全“熔化”。吸收光谱数据(聚集分子的分数:αagg和温度:T，详情见SM†)首先用等距模型拟合，但观察到与模型的偏差。因此，光谱数据进一步与Meijer等人提出的成核-延伸(N E)超分子聚合模型拟合，符合程度令人满意。BDP-a的临界延伸温度(Te，表S5)和摩尔焓(ΔHe)分别为318 K和17.9 kJmol 1。BDP-a - J聚集体的无因次平衡常数(Ka)估计为4.7×10 3，表明聚集体过程具有高度的协同性。对于BDP-b，通过温度依赖性吸收光谱研究估计Te、ΔHe和Ka的热力学值分别为333.0 K、30.5 kJmol 1、1.1×10 2。Te、ΔHe和Ka越高，表明BDP-a与BDPb相比具有更强的聚集倾向和更高的协同度。
在正己烷/CHCl3中，只有在0-10℃的制备温度范围内才能观察到理想的J-团聚体，当温度升高到30℃时，BDP-a的J-能带几乎消失，说明环熔BODIPY J-团聚体的生长与制备温度密切相关。随后，通过逐渐增加好溶剂CHCl3的比例至34%，也观察到BDP-a J聚集体完全解体，进一步证实了J聚集过程是可逆的。根据晶体学数据，共考虑了12个相邻的BDP-a分子进行分子间激子耦合。因此，估算得到的光谱位移Δ~vagg-mon< 2049 cm-1，与光谱实验数据(Δ~vexp= 2138 cm-1)吻合较好。这一结果表明，BDP-a - J聚集体的色移是由于分子的滑移堆叠排列，导致强烈的偶极子-偶极子相互作用，降低了能隙。
为了评估BDP-a/b外围多个给电子甲氧基修饰对调节分子堆积模式的重要性，我们致力于合成没有外围给电子基团的环状融合染料，最终得到了BDP-c。由于缺乏大量甲氧基修饰，BDP-c在CHCl3中的最大吸收波长与BDP-a相比蓝移至762 nm (λabsmax: 802 nm)。然而，在相同分子浓度下，当正己烷含量达到99%时，BDP-c在正己烷/CHCl3混合物中的吸收带变化可以忽略不计。随后，在正己烷中，从2-20 μM增加BDP-c的浓度，BDP-c的吸光度严格遵循Lambert-Beer定律，证明分子不聚集。考虑到BDP-c可能在正己烷中有更好的溶解度，用THF/水代替溶剂混合物。当水比增加到90%时，BDP-c的吸收峰减小并变宽，表明BDP-c已经聚集。此外，BDP-c的聚集吸收峰没有出现明显的红移和bulshift，这表明所谓的Maggregates(其滑移角在“魔”角附近的产生，θ= 54.7°)。此外，模拟BDP-c的分子堆积也显示了非常相似的54.2°θ，进一步验证了其m -聚集体模式。与此相反，当将烷烃溶剂替换为水溶液时，在THF/水混合物中也观察到BDP-a和BDP-b的尖锐的j波段吸收峰。
虽然BDP-a表现出优异的J聚集行为，但制备温度严格限制在低温，不利于J聚集体的长期保存。因此，我们将注意力转向了经典的三嵌段表面活性剂F-127，它可能有助于稳定水中的BDP-a J聚集体:它的疏水片段可以维持分子J聚集的堆积模式，而亲水片段可以增加J聚集体在水中的溶解度。按比例加入F-127和BDP-a(溶解在CHCl3中)，然后在真空中完全除去溶剂CHCl3(净F-127中BDP-a)，然后在水中溶解。令人惊讶的是，得到的溶液变成了蓝色，λabsmax在674 nm处，表明BDP-a产生了H聚集体。透射电子显微镜(TEM)观察到BDP-a hagregates的形貌为纳米颗粒(HBDP-a NPs)，粒径约为17 nm。
BDP-a纳米粒子的制备与光热性能研究
我们认为可以先制备J-聚集体，然后加入F-127使其稳定。在这种策略下，我们成功地制备了具有超高消光系数2.71×105 M-1 cm-1的BDP-a J-聚酰亚胺NPs (JBDP-a NPs)，其形貌显示为直径约41 nm的纳米球这是一个非常有希望的结果，因为它不仅保持了优异的聚焦性能，而且粒径也满足了增强渗透性和保留率(EPR)的效果。此外，经过14天的观察，JBDPa NPs的吸光度仅发生微小变化，证明F-127稳定BDP-a Jaggregates的策略是非常有效的。那么，我们想知道，由于BDP-a可以同时产生h -聚集体和J-聚集体，是否可以观察到它们之间的相关性，因此，用分光光度计监测HBDP-a NPs溶液，观察到当溶液中含有2% THF时，h -聚集体在生长7天后转化为J-聚集体。随后，通过TEM对溶液进行观察，发现这些小的hagaggregation NPs意外地生长成长度超过6 μm，宽度约为25 nm的纳米线，其j波段比J聚集体NPs的j波段更宽。这表明通过途径调控可以获得两种形态的BDP-a J-聚团:快速生长的纳米球和缓慢生长的纳米线。加热会加速HBDP-a NPs向jaggregate的转变。HBDP-a NPs可以在60min(5-93°C)内完全转化。受到这一有趣现象的鼓舞，我们通过增加HBDP-a NPs溶液中良好溶剂THF的比例来进一步研究这种转变。当THF分数逐渐增加到20.0%时，h -聚集体慢慢转变为J-聚集体，而不是单体。然后继续增加THF的比例至51.5%，J-聚集体进一步转化为单体。这证明了BDP-a的h -聚集体处于动力学上有利的亚稳态，随着时间的延长、加热或加入良好溶剂，h -聚集体会转变为热力学上更稳定的J-聚集体。一旦生成BDP-a - J聚合，它们就特别稳定。即使加热温度达到93℃，它们的吸收带也没有变宽或减小，表明可以忽略分解为单体或h -聚集体。
由于分子间激子耦合的存在，J聚集体可能增强系统间交叉产生ROS的可能性。因此，我们选择2 '，7 ' -二氯二氢荧光素(DCFH)作为ROS指示剂，结果表明，在照射下，JBDP-a NPs可以氧化DCFH，使DCFH溶液的荧光增强17.8倍。此外，在相同浓度和照射条件下，JBDP-a NPs的ROS产量明显高于吲哚菁绿(ICG)和空白对照组。接下来，利用自由基清除剂(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮:TEMP和5,5-二甲基-吡啶- n -氧化物:DMPO)，通过电子顺磁共振谱表征JBDP-a NPs产生●OH。此外，在相同的测试条件下，BDP-a单体在甲苯中不能产生●OH信号，这可能进一步揭示了分子激子耦合促进了ROS的产生。这些结果表明JBDP-a NPs具有作为光敏剂的潜力。JBDP-a NPs表现出优异的J聚集行为，有效地将其吸收带提升到SWIR区，具有显著的红移，与商用915 nm激光器相匹配。此外，JBDP-a NPs显示出极高的摩尔消光系数(2.71×105 M-1 cm-1)，允许激光功率密度显著降低。因此，研究了JBDP-a NPs的光热性质。在功率为0.32 Wcm-2的915 nm激光照射下，JBDP-a NPs水溶液在照射4 min后迅速升温至53.9℃，16 min后迅速升温至64.0℃(ΔT=32.9℃)。相比之下，去离子水溶液的温度仅升高到34.5℃(16 min，ΔT=2.9℃)。通过记录整个加热和冷却过程，并结合冷却时间常数，计算出915 nm激光照射下JBDP-a NPs的PCE为72.9%。在相同条件下，商业光热剂IR-1061 NPs [20a-b]的PCE计算值仅为45.9%。此外，在808 nm激光照射下，测定并计算出JBDP-a NPs的PCE为75.9%，而商用光热剂ICG仅为15.3%。JBDP-a纳米线和BDP-a单体的PCE值较低，分别为64.6%和54.3%。PCE是光热剂的关键参数之一，JBDP-a NPs表现出极好的PCE值，高于许多先前报道的近红外光热剂，非常有利于在超低激光功率密度下进行PTT。
JBDP-a NPs的加热温度具有明显的浓度/功率密度依赖性:随着JBDP-a NPs浓度或激光功率密度的增加，JBDP-a NPs溶液的升温也显著增加。抗光漂性能是光热剂性能的另一个关键因素。令人欣慰的是，经过10个周期的辐照/冷却后，JBDP-a NPs的最高温度仍能保持在65℃，而商用光热剂IR-1061 NPs的最高温度则呈现出明显的下降趋势。更重要的是，在10个循环前后，JBDP-a NPs的吸收光谱几乎一致，表明JBDP-a NPs具有优异的光热稳定性。同样，在808 nm激光照射下，JBDP-a NPs经过10个周期的辐照/冷却后，仍然保持了其优异的光热性能，而商用光热剂ICG经过1个周期后，升温幅度明显下降。这些结果有力地证明了JBDP-a NPs在PCE和光热稳定性方面都明显优于商用光热剂IR-1061和ICG。
基于超高的PCE、非凡的光热稳定性和ROS的同步释放，我们在细胞水平上研究了JBDP-a NPs在PTT中的作用。首先，采用CCK-8法测定JBDP-a NPs的暗细胞毒性。在孵育48 h后，即使JBDP-a NPs浓度达到100 μM, 4T1细胞存活率仍接近100%，表明JBDP-a NPs具有良好的生物相容性。考虑到JBDP-a NPs的最高PCE(~72.9%)和超高消光系数(271400 M-1 cm-1)，选择了超低功率密度0.27 Wcm-2的915 nm激光器作为光源。辐照15 min后，细胞活力呈剂量依赖性显著下降，计算出的半抑制浓度(IC50)值约为8.0 μM。研究结果有力地支持了JBDP-a NPs表现出优异的光热性能。它们能够产生足够的热量来有效杀死细胞，并且即使在超低强度近红外照射下也能保持较低的IC50值。因此，JBDP-a NPs可以被视为主要的近红外光热剂之一。商用IR-1061 NPs表现出相对较高的暗毒性，IC50值为9.5 μM(暗毒性)。IR-1061 NPs的暗毒性和光毒性差异很小。这可能是由于使用的激光功率密度和分子浓度太低，使IR-1061 NPs无法显示其PTT能力。此外，与JBDP-a NPs (10μM)孵育后，细胞光毒性也表现出激光功率密度依赖的响应。相反，不含JBDP-a NPs的细胞作为空白对照组，没有表现出任何光毒性。
为了可视化JBDP-a NPs对肿瘤细胞的破坏PTT，使用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染料进行活死细胞染色。AO和PI根据细胞膜通透性的不同可以区分活细胞和死细胞，活细胞发出绿色荧光，死细胞发出红色荧光。只有当JBDP-a NPs (15 μM)和激光照射(0.27 Wcm-2)同时作用时，4T1细胞才会出现大面积的红色荧光，这是由于细胞死亡造成的，这与CCK-8的实验结果一致。另一方面，激光照射下的细胞中也检测到JBDP-a NPs产生ROS。将4T1细胞与ROS指示剂DCFH和JBDP-a NPs (20 μM)孵育，然后暴露于激光照射下，导致荧光明显增强。相比之下，仅用DCFH孵育细胞时，照射前后荧光无明显差异。此外，还使用●OH探针羟基苯基荧光素(HPF)表明，JBDP-a NPs在激光照射下可以在细胞中产生●OH。
由于JBDP-a NPs在细胞中具有优越的PTT性能，我们继续在体内评估其抗癌PTT功效。荷瘤小鼠随机分为6组(每组5只):JBDP-a NPs加/不加激光照射组、IR-1061 NPs加/不加激光照射组、PBS加/不加激光照射组。注射JBDP-a NPs后，将荷瘤小鼠置于激光照射下，激光功率密度为0.27 Wcm-2 (915 nm)。20 s内肿瘤部位温度迅速升高到46.0℃，照射10 min后达到56.0℃，而PBS组肿瘤温度只能升高到36.3℃。相比之下，在相同的实验条件下，商业光热剂IR-1061 NPs似乎受到低注射浓度和超低激光功率密度的限制。结果，照射10 min后，肿瘤部位温度仅升高至38.1℃。
在治疗过程中，只有注射JBDP-a NPs并暴露在激光下的小鼠肿瘤体积明显减小。相比之下，其他五组，包括注射IR-1061 NPs后再进行激光照射的小鼠，以及注射JBDP-a NPs但未进行激光照射的小鼠，肿瘤生长明显且快速。12天治疗期结束时，将各组肿瘤切除分析。值得注意的是，我们观察到，只有注射JBDP-a NPs并暴露在915 nm激光下的小鼠肿瘤几乎完全消融，这与其他5个对照组有显著差异。此外，在整个治疗过程中，各组小鼠的体重逐渐增加，无显著差异，从而证实了JBDP-a NPs在小鼠体内具有良好的生物相容性。
最后，实验组的H&E染色(JBDP-a NPs+)显示细胞核游离和坏死，而其他组的肿瘤细胞呈圆形，饱满，排列紧密。这表明JBDP-a NPs能够有效地破坏肿瘤组织，抑制肿瘤增殖。同时各组主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)的H&E染色在体内均未见明显的组织损伤和炎症病变，说明JBDP-a NPs具有良好的生物安全性。综上所述，上述结果表明，在超低激光功率密度下，JBDPa NPs足以破坏肿瘤组织并导致有效的肿瘤消融。此外，JBDP-a纳米光热性能比IR-1061商用纳米光热性能更好，生物安全性更高，是一种很有前景的光疗纳米剂。
总结
本研究通过对芳香环[b]-融合氮杂- bodipys进行外围多个甲氧基修饰，有效调节分子表面静电势，成功诱导经典π共轭支架的滑移排列，生成理想的J聚集体。有趣的是，BDP-a J聚集体的吸收峰表现出明显的红移~166 nm (804!968 nm(正己烷)的吸光度比单体提高了1.7倍。重要的是，当BDP-a与F-127自组装时，通过不同的样品制备方法可以选择性地制备球形J聚集NPs(直径:40.7 nm)或h聚集的较小NPs(直径:16.7 nm)。经过几天的生长，球形h聚集的NPs可以继续生长成J聚集的纳米线。由于其超高消光系数(2714000 M-1 cm-1)、良好的PCE (η= 72.9%)和合适的粒径，球形SWIR jaggregation NPs在体外(IC50=8.0 μM)和体内(IC50= 915 nm)的超低激光功率密度(0.27 Wcm-2)下可实现PTT和PDT的联合治疗，有效地消融肿瘤细胞并有效抑制肿瘤细胞的增殖。
参考文献
Tuning Shortwave-Infrared J-aggregates of Aromatic Ring-Fused Aza-BODIPYs by Peripheral Substituents for Combined Photothermal and Photodynamic Therapies at Ultralow Laser Power Xing Guo, Wanle Sheng, Hongfei Pan, Luying Guo, Huiquan Zuo, Zeyu Wu, Shizhang Ling, Xiaochun Jiang,* Zhijian Chen,* Lijuan Jiao, and Erhong Hao*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202319875，doi.org/10.1002/anie.202319875
