内容提要
本文介绍了基于有机合成和纳米科学方法设计NIR-II窗口发射荧光团和探针的最新进展，报告了NIR-II宽场和显微镜成像模式的进展，重点关注临床前成像和有前景的临床转化案例研究，最后概述了NIR-II成像在生物医学研究和临床成像中更广泛应用面临的问题和挑战。
NIR-II荧光团和纳米探针的最新进展
用于生物成像的荧光探针应具有高亮度（高量子产率（QY）和摩尔吸光系数/消光系数）和生物相容性。NIR-II荧光团的QY低于其可见光或NIR-I对应物。在分子荧光团中，激发态的零振动能级与基态的较高能量振动能级之间的非辐射弛豫会淬灭分子荧光，并且这种效应，被称为“能隙定律”，随着长波长处能隙的缩小而变得更加显著。在水环境中，NIR-II分子荧光团通常具有更大的π共轭主链，会受到更强的分子间相互作用，这导致NIR-II发射进一步非辐射衰减。据报道，水溶液中大量存在的羟基是稀土纳米颗粒（RENPs）NIR-II发光的严重猝灭剂。分子荧光团的非极性共轭主链和无机纳米颗粒的疏水包覆层需要进行有效的亲水修饰以实现生物相容性，而这一过程会大幅降低荧光量子产率。
无机纳米结构NIR-II探针
首次NIR-II成像利用了1000-1700 nm范围内的光致发光单壁碳纳米管，其发射波长取决于纳米管的手性和直径（0.7-1.4 nm）。NIR-II量子点，如硫化银（Ag2S；1100-1400 nm）、硫化铅（PbS；1000-2000 nm；量子点b：1500-1700 nm，量子点c：1700-2000 nm）和砷化铟（InAs；900-1600 nm）表现出比单壁碳纳米管更高的荧光量子产率。这些量子点通常会包覆一层钝化壳以避免氧化，从而得到在水溶液中具有明亮NIR-II发射的核壳量子点。稀土纳米颗粒（RENPs）具有优异的光学性能，覆盖NIR-II范围的窄带发射、长发光寿命以及X射线照射后的俄歇效应基长余辉。为增强NIR-II发射，Ce3+掺杂和立方相策略可分别抑制上转换，同时将1550 nm处Er3+下转换发光强度提高约9倍和8倍。最近基于Tm3+发射体的立方相稀土纳米颗粒已被开发，其在1600-1700 nm亚NIR-IIb波段表现出荧光放大。具有超小尺寸的金分子簇（Au25，~1.6 nm）在1000-1400 nm范围内显示出发光特性。无机纳米结构NIR-II探针通常在有机溶剂中合成，并涂覆亲水性交联聚合物层（“P3涂层”），以赋予其高生物相容性，用于临床前研究。P3交联表面涂层可实现快速胆汁清除，并减少多种纳米材料（包括稀土纳米颗粒、硫化铅量子点和超顺磁性氧化铁纳米颗粒）的长期滞留诱导副作用，从而改善其体内药代动力学，增强其在纳米医学中的潜在应用。
分子荧光团
分子荧光团是重要的NIR-II探针，因其具有明确的结构、丰富的化学和结构可调性，以及通常较高的生物相容性和良好的药代动力学特性。迄今为止，NIR-II分子荧光团包括聚次甲基、供体-受体分子、硼二吡咯亚甲基（BODIPY）、罗丹明和金属-大环配合物。利用具有先进特性的有机荧光团已实现高性能的体内NIR-II荧光成像，如峰值吸收波长高达1400 nm、105 mol−1 cm−1的大吸收系数、>5 %的高量子产率（QY）或在NIR-IIb窗口的长发射。这些分子通常具有大共轭主链和高疏水性。为了获得水溶性，研究人员通常将这些分子包埋在两亲性聚合物基质中或用亲水性侧链对其进行功能化。NIR-II分子荧光团的吸收/发射波长可通过增加共轭主链长度、增强供体/受体单元强度或形成J聚集体实现红移。已证实现可在多激发波长下，利用具有精细调节杂环修饰的黄烊盐聚甲炔染料，进行NIR-II视频速率荧光多色成像。由于能隙定律，红移荧光团通常表现出较低的量子产率，尤其是峰值吸收超过1000 nm的分子荧光团。水分子与共轭主链之间的强相互作用导致NIR-II分子荧光团发生显著的非辐射衰减。因此，在水相条件下保护共轭主链免受水分子影响对于获得高荧光量子产率至关重要。
荧光蛋白
基因编码荧光蛋白（FPs）已被广泛用于对细胞或生物体中的分子、细胞或结构进行长期可视化和追踪，且具有高度特异性。最近，人们对NIR-I荧光蛋白的发射尾延伸至大于1000 nm的NIR-II窗口的兴趣日益浓厚，这得益于它们能够减少光散射、提高成像深度/分辨率并降低扩散噪声。细菌光敏色素感受器（BphPs）、蓝细菌色素（CBCRs）和别藻蓝蛋白（APCs）已被用作设计NIR-I荧光蛋白的来源。研究表明，从细菌光敏蛋白（BphPs）改造的荧光蛋白（FPs）（例如iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713和iRFP720）和CBCRs（例如单体miRFP670nano和miRFP718nano）的工程化荧光蛋白在NIR-II窗口具有荧光发射尾。iRFP713已被敲入小鼠基因组，用于长期监测肝脏再生模型，并在大于900 nm处进行成像。miRFP718nano的近红外二区荧光亮度是miRFP670nano的三倍，分别是miRFP709和miRFP703荧光亮度的1.5倍和两倍。目前使用50 mW cm−2的激发功率密度和30 ms的曝光时间，在1050 nm以上对miRFP718nano的性能进行了肝脏炎症模型评估。
NIR-II成像模式
NIR-II二维宽场成像
NIR-II宽场荧光成像采用激发光源（如扩束激光束、发光二极管（LED）、X射线束或切伦科夫辐射）来照射整个三维物体（例如小鼠），并将产生的NIR-II荧光投射到相机捕获的二维图像上。非同轴激发是常用的方法，以避免使用二向色镜以及因样品强烈反射而产生的背景信号。其他NIR-II宽场模式不需要激发光源，包括化学发光、生物发光和余辉荧光成像。模体或组织的宽场成像显示，NIR-II成像的穿透深度和分辨率分别约为NIR-I成像的1.7倍和2.1倍，不过这些数值受成像条件的影响显著。在不同子窗口进行NIR-II成像时，成像端需要合适的相机和光学滤镜。对于NIR-IIa和NIR-IIb荧光成像，使用具有宽动态范围、低读出噪声和低暗电流的制冷型铟镓砷（InGaAs）相机（900-1700 nm）。对于NIR-IIc和NIR-IId宽场成像，相机基于小带隙光敏半导体，如“扩展型铟镓砷”（900-2600 nm）、锑化铟（InSb，960-5000 nm）和碲化镉汞（HgCdTe或MCT，800-14000 nm）。最近，有人利用MCT相机探索了NIR-IIc宽场成像，但与常用的铟镓砷（InGaAs）相机相比，其成本更高、噪声更大且灵敏度更低。使用快速InGaAs相机，NIR-II宽场成像的采集速度已达到300 fps。覆盖整个小鼠视野的NIR-II宽场成像分辨率约为100 µm，这受限于现有相机的像素数量较少。
NIR-II三维共聚焦显微镜
NIR-II共聚焦显微镜采用紧密聚焦的激光束，在x-y-z方向进行光栅扫描，逐点激发样品中的荧光团。在每个点，发射的荧光通过针孔后被检测，以剔除离焦信号，该信号用于构建三维（3D）图像。与可见光共聚焦显微镜（可见光下<100 µm）相比，通过采用长激发和发射波长、高量子产率荧光团以及高灵敏度、低噪声检测器，共聚焦NIR-II荧光成像将组织穿透深度极限提高了约十倍。最初，NIR-II共聚焦显微镜是通过使用NIR-I激发、NIR-II发射和铟镓砷光电倍增管（PMT）探测器实现的。例如，在785 nm激发下对小鼠血管中的QDb进行NIR-IIb共聚焦成像，在完整的小鼠肿瘤中以小于10 μm的分辨率分辨出约700 μm的血管。使用793 nm激发和大于1000 nm发射，对开颅术后聚集诱导发光（AIE）点填充的脑血管进行共聚焦成像，在小鼠脑中实现了800 μm的穿透深度和约9 μm的分辨率。最近，我们将超导纳米线单光子探测器（SNSPD）用于NIR-II共聚焦显微镜，发现它优于铟镓砷PMT，具有更短的时间抖动、更高的灵敏度和更低的噪声。采用时间抖动约为109 ps的自制SNSPD，使用800 nm飞秒激光激发进行NIR-II寿命成像。
采用1310 nm激发的NIR-II共聚焦显微镜、量子点b型探针和单光子超导探测器能够在开颅手术后对海马体区域深度约1.7 mm处的脑血管进行在体成像，接近1280 nm激发的双光子显微镜所实现的约1.6 mm成像深度。单光子超导探测器的可调光谱响应范围为NIR-IIc和NIR-IId窗口的共聚焦成像提供了机会，突破了铟镓砷光电倍增管的探测极限。为了突破在体无创单光子成像的穿透深度限制，研究人员使用量子点c型探针和单光子超导探测器演示了1650 nm激发的NIR-IIc共聚焦显微镜，在完整小鼠头部实现了约1.1 mm的成像深度。它还允许以单细胞和单血管分辨率对小鼠腹股沟淋巴结进行无创穿透组织分子成像。这是首次将大于1500 nm波段的激发光和发射光同时用于在体共聚焦成像，以最小化光散射并最大化成像深度。
用于NIR-II单光子共聚焦显微镜的最长激发波长为1650 nm，与多光子显微镜所用的激发波长（约1700 nm）接近，且激发光强度在穿过组织时的衰减情况相似。被激发探针的单光子荧光发射强度与激发光强度呈线性关系，而双光子和三光子荧光强度则分别与激发光强度的二次方和三次方成正比。这表明，在激发波长相近的情况下，共聚焦显微镜的发射强度衰减更慢，成像深度更深。与多光子活体显微镜不同，NIR-IIc共聚焦显微镜可通过完整组织进行无创在体成像。多光子成像的优势在于其更高的信噪比以及基因工程探针的可用性。通过将NIR-IIc共聚焦显微镜与多光子显微镜相结合（两者均使用约1650–1700 nm激发光），可以最大限度地发挥多通道分子特异性和细胞特异性成像的能力，从而研究复杂的生物系统。
NIR-II三维光片显微镜
光片显微镜（LSM）利用正交排列的照明和宽场检测实现高速光学切片和三维体积成像。这种方法可最大限度地减少光毒性并提高亚细胞分辨率，且通过使用晶格照明和自适应光学可实现亚衍射极限分辨率。然而，在可见光窗口对活体组织进行在体成像时，LSM的成像深度较浅（小鼠脑开颅后约200 μm），这是由于光散射导致的。1040 nm的双光子LSM由于NIR-II激发光的散射减少，能够对小鼠脑进行更深层的成像（可达约300 μm），且分辨率较高。通过使用贝塞尔光束或艾里光束进行激发，可进一步扩展穿透深度，但这仍受限于可见光发射光的散射。开发了一种NIR-IIb区激光扫描显微镜，其激发波长约为1319 nm，检测波长约为1500-1700 nm，用于小鼠体内成像。这种NIR-II LSM避免了组织散射和吸收造成的阴影和条纹，这些是可见光LSM常见的问题。NIR-IIb LSM能够对完整小鼠头部进行无创成像/切片，总穿透深度约为750 μm，可分辨连接小鼠颅骨和大脑皮层的血管通道。这些通道被免疫细胞用于在颅骨骨髓和皮层之间迁移，以保护小鼠大脑的免疫系统。在另一项应用中，通过NIR-IIb LSM以20 fps的帧率监测肿瘤血管中不规则迁移的PD-1+细胞。NIR-II光的波长是可见光的2-4倍，其激光扫描显微镜的衍射极限空间分辨率低于可见光激光扫描显微镜。此外，深层组织的NIR-II成像仍会受到光散射的影响，导致背景升高并降低空间分辨率。具有自修复或衰减补偿特性的扫描艾里光束已被用于NIR-II激光扫描显微镜的激发，以提高信噪比、组织穿透力和z方向分辨率。
临床前成像中的应用
自2009年以来，NIR-II成像已在临床前广泛开展，其应用包括：可视化血管结构并测量心血管疾病的血流动力学和灌注情况、淋巴结成像、分子成像、以及功能成像。
血管与血流动力学成像
用于血流动力学的动态NIR-II成像速度已从最初使用SWNT探针时的约5 fps提升至最近使用ErNPs时的约90 fps。研究人员分别利用循环碳纳米管、量子点、AIE纳米点和金簇通过NIR-II成像对心血管疾病模型进行了研究。已在周围动脉疾病（PAD）、大脑中动脉闭塞（MCAO）中风和创伤性脑损伤（TBI）疾病模型中实现了对单个血管血流灌注和血流动力学的动态监测。在PAD小鼠模型中，利用NIR-IIb窗口的PbS/CdS量子点对血管再生进行了纵向成像。在多形性胶质母细胞瘤的无序脉管系统中，还使用InAs量子点对血流进行成像，以观察脑肿瘤生长对脑血管的影响。通过主成分分析（PCA）的动态对比增强成像对肿瘤、动脉血管和静脉血管进行了识别。
淋巴结成像
前哨淋巴结是原发肿瘤的初始引流淋巴结，是癌症转移首先发生的部位。定位前哨淋巴结进行活检对于评估淋巴结区域的转移扩散至关重要。NIR-II荧光成像可实现淋巴结和淋巴管的精确定位，与NIR-I窗口相比，具有更好的对比度和分辨率。最近，研究人员开发了“超隐形”金-磷酸胆碱（Au-PC）纳米簇探针，用于肿瘤内给药后对癌症肿瘤的引流淋巴结进行成像，在体内受到周围组织的干扰最小。
分子成像
NIR-II肿瘤生物标志物分子成像一直通过与抗体，或其他配体偶联的靶向近NIR-II探针来实现，该成像技术能够实现高空间分辨率和肿瘤与正常组织的高对比度区分，具有较高的肿瘤与正常组织比值（T/NT）。在1000-1400 nm光谱范围内，肿瘤与正常组织比值为8-20；在NIR-IIb窗口，该比值高达约40，高于NIR-I窗口的肿瘤与正常组织比值。吲哚菁绿（ICG）与贝伐珠单抗偶联后被用于靶向大鼠原位结直肠癌，并通过白光和NIR-II内窥镜系统进行成像。
淋巴结中的高内皮微静脉（HEVs）是小的毛细血管后微静脉，负责介导免疫细胞从血液循环进入淋巴结。最近，利用靶向抗体-NIR-II探针，体内NIR-IIc共聚焦显微镜已被用于对小鼠腹股沟淋巴结中的HEVs、CD169+被膜下窦巨噬细胞和CD3+ T细胞进行非侵入性穿透组织分子成像。
我们采用NIR-II分子成像技术评估小鼠对免疫疗法的免疫应答。利用ErNPs（荧光寿命~4.6 ms，发射波长~1600 nm）和QDb（荧光寿命~46 μs，发射波长~1600 nm）不同的荧光寿命，实现了PD-L1和CD8的在体双通道NIR-IIb分子成像，揭示了在ErNPs偶联抗PD-L1治疗后，CD8+细胞毒性淋巴细胞（CTLs）在CT26肿瘤中的聚集。采用宽场成像和结构光照明显微镜对小鼠CT26肿瘤微环境进行多通道和多尺度分子成像，以单细胞水平纵向追踪CD4、CD8和OX40在肿瘤内注射免疫治疗用胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）和OX40抗体后的变化。
最近，通过将卵清蛋白（OVA）共价偶联和B类CpG（CpG B）静电结合到pErNP29上，开发出了一种癌症纳米疫苗。皮下注射后，NIR-IIb成像显示纳米疫苗通过淋巴管迅速迁移至腹股沟淋巴结（iLN）。两次疫苗接种导致肿瘤根除以及小鼠的治愈/存活。宽场成像和结构化照明显微镜（LSM）显示，经治疗的小鼠肿瘤中募集了大量OVA抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）这是首次对体内抗原特异性CTLs进行成像，以关联癌症疫苗的免疫治疗效果。
NIR-II功能成像
利用功能成像探测环境参数和细胞对刺激的反应是体内NIR-II成像的另一个令人兴奋的方向，例如NIR-II荧光分子可对外部刺激或环境做出响应，如pH值、氧化还原物质、硝基还原酶、β-淀粉样蛋白斑块和细胞内吞作用。将Schaap’s二氧杂环丁烷与供体-受体核心缀合，构建了用于硫化氢的单分子NIR-II化学发光探针。最近的一项进展利用pErNPs在特定激发波长（650、808和980 nm）下氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的吸收差异，实现血管中氧合血红蛋白饱和度（sO2）的NIR-IIb成像，从而能够可视化肿瘤相关血管中的sO2水平。具有强NIR-II荧光的Au22团簇表现出强大的类酶活性，有望用于氧化应激的早期干预。
NIR-II成像引导手术
临床前NIR-II成像用于术中导航是一个活跃的研究领域，具有潜在的临床转化价值。在NIR-II成像导航下切除肿瘤（例如胶质母细胞瘤、胰腺肿瘤、结直肠肿瘤、卵巢肿瘤和乳腺肿瘤）具有巨大前景。利用靶向肿瘤血管生成的ErNP-TRC105进行肿瘤NIR-IIb分子成像，可获得高达约300的肿瘤与肌肉信号比，实现了精确到少数细胞水平的高精度影像引导肿瘤切除。最近的一项研究表明，成功切除了用QDb标记的淋巴结，实现了约200的高淋巴结与肌肉比值。在另一项研究中，使用AIE纳米探针的NIR-II成像引导手术实现了严重炎症性肠病的完全切除，并确保了安全的手术吻合。
迈向临床成像
为了实现NIR-II荧光成像的成功临床转化，开发可安全用于人体的造影剂至关重要。多个研究小组发现，传统的NIR-I有机染料，如ICG和IRDye800CW，其发射光谱尾部延伸至NIR-II窗口，可用于NIR-II成像，从而受益于减少的光散射以及更高的成像对比度和分辨率。由于吲哚菁绿（ICG）是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的荧光团，使用ICG进行NIR-II成像的人体临床试验风险相对较低，但需要切换到基于铟镓砷（InGaAs）的成像系统，而该系统尚未经过严格的监管审批。基于此，研究人员在人体患者中成功实施了NIR-II荧光引导下的肝肿瘤手术切除，术前通过静脉注射0.5 mg kg-1剂量的ICG，结果显示其肿瘤检测灵敏度和检出率均高于NIR-I区域成像。然而，ICG是一种非靶向探针，由于其会在其他组织中积聚，因此可能导致肿瘤假阳性结果。在成像引导手术中，用于主动肿瘤靶向的IRDye800CW生物偶联物已在NIR-I窗口进行了临床测试。IRDye800CW偶联物的发射光谱尾部超过1000 nm，有望更好地确定肿瘤边缘。
临床转化的另一个有前景的方向是NIR-II灌注成像。近红外二区ICG标记血液成像已被用于观察吻合血管和挽救的远端肢体。与NIR-I成像相比，它能够在深筋膜水平观察皮肤穿支血管，并分别在皮瓣移植前后观察再血管化，具有更高的对比度、更好的分辨率和更长的观察时间。已有利用水的吸收特性通过无标记方法进行短波红外（SWIR）成像的临床试验报道。其中一个例子是耳镜，它利用1480 nm处水吸收带的负对比度来检测中耳液。
展望与未来方向
探针和荧光团
目前，具有高吸收率、量子产率和水溶性，且能够经肾脏排泄并与靶向配体缀合的有机NIR-II荧光团仍然稀缺。人们期望主要在NIR-IIb子窗口发射的分子能够与基于无机量子点（QDs）和稀土纳米颗粒的纳米探针相竞争。另一个挑战是合成光学性质对环境和刺激敏感的功能性NIR-II荧光团，特别是用于基于成像的pH值、气体分子、Ca2+和其他离子以及神经元离子通道跨膜电压和动作电位的传感。近红外二区荧光团较宽的发射光谱（半峰全宽约75-290 nm）限制了多通道成像。通过使用具有不同窄带发射的多色探针、不同激发波长的探针以及不同荧光/发光寿命的探针，所有这些探针都与分子特异性配体缀合以靶向体内不同分子，可以扩展多通道分子成像。对于无机基纳米颗粒，期望在1000-2300 nm范围内具有窄的发射宽度，且光谱重叠小。目前，缺乏水溶性、生物相容性的NIR-IId探针（发射峰约2200 nm）。开发具有可调荧光寿命的NIR-II探针是增加体内多通道分子成像的另一种重要方法。通过结合连续波和寿命成像，使用量子点和稀土纳米颗粒实现了三通道NIR-IIb成像。开发基因工程NIR-II荧光蛋白一直是一项艰巨的挑战，但其成功将重现绿色荧光蛋白（GFP）的革命，无疑会推动NIR-II领域的发展，并使这种成像方式被生物学家和医学科学家更广泛地采用。自然界中存在NIR-II荧光蛋白，包括Blastochloris tepida、Blastochloris viridis和Halorhodospira halochloris在内的几种紫色光合细菌，具有基于细菌叶绿素b的光捕获复合物，在NIR-II范围内表现出吸收和荧光特性。其中，已观察到来自Blastochloris viridis的LH1-RC复合物发出NIR-II窗口内的峰值荧光，这为NIR-II荧光蛋白的开发带来了机遇，但这些非常大的蛋白质复合物在哺乳动物细胞的基因标记策略中仍然难以使用。
NIR-II成像设备与方法
具有高灵敏度、低噪声、1000-2300 nm宽光谱范围和更多像素数量的新型相机技术，对于提升NIR-II成像性能和能力至关重要。NIR-II范围内的高量子效率图像增强器是时间分辨/超快成像以及弱荧光检测与成像所必需的。需要比InGaAs更优异的NIR-IIc和NIR-IId成像相机，以优化2D宽场和3D LSM模式下的体内荧光成像优势。诸如SNSPDs之类的点探测器已实现NIR-IIc子窗口中的高分辨率、深层组织共聚焦显微镜，但对于约2200 nm的NIR-IId范围，在低暗噪声条件下仍面临挑战。为了突破分辨率限制，期望将光学超分辨率方法引入NIR-II窗口的显微成像中，类似于为可见光范围开发的方法，例如非线性结构光照明显微镜（SIM）、随机光学重建显微镜（STORM）、光激活定位显微镜（PALM）和受激发射损耗（STED）显微镜。为实现这些，需要专门设计的NIR-II荧光探针和低光敏感探测器。
临床转化
临床前体内NIR-II荧光成像已产生了大量有望用于潜在临床转化的研究结果。然而，一个主要障碍是缺乏经临床验证的高性能NIR-II荧光团或纳米探针，这些探针需安全且具有适合人类使用的良好药代动力学特性。尽管FDA批准的ICG具有良好的安全记录，并在NIR-II窗口有尾部荧光发射，但其发射光大多在<1200 nm范围内，成像仍受到严重的光散射和高背景的影响。ICG还缺乏与靶向配体缀合所需的官能团，不能用于分子成像。因此，需要具有与ICG相似安全性、发射波长更长（理想情况下在NIR-IIb亚窗口）的替代染料或探针。在无机探针中，稀土下转换纳米颗粒是高性能（低散射、低自发荧光）NIR-IIb成像窗口的强发光体，并已成为优良的分子成像剂。类似组成的上转换纳米颗粒在小鼠临床前研究中已被证明具有高度安全性。然而，由于探针放大生产问题以及缺乏临床环境中的安全性数据，其临床转化尚不确定。量子点（QDs）由于使用了有毒元素，挑战更大。另一种极具前景的NIR-II探针包括分子金簇，如Au25 GSH和Au25PC，因为金被广泛认为是安全元素，这些簇可通过肾脏快速排泄，几乎没有非特异性组织结合/摄取，并且在NIR-II淋巴结成像中表现出比ICG更高的性能。无论如何，任何NIR-II试剂的临床转化都必须经过严格的I至III期临床试验，以评估其药代动力学、毒性、稳定性、副作用和对人类的风险，并证明其益处。
参考文献
In vivo NIR-II fluorescence imaging for biology and medicine, Feifei Wang, Yeteng Zhong, Oliver Bruns, Yongye Liang, Hongjie Dai, Nat. Photonics. 2024, 18, 535-547. https://doi.org/10.1038/s41566-024-01391-5
