内容提要
在第二近红外窗口(NIR-II，1000-1700 nm)发射荧光的有机小分子染料，具有减少光子散射，抑制组织自体荧光和组织深层渗透等独特的光学性质，而受到生物医学成像领域的关注，这些优势使NIR-II荧光成像(FLI)具备高时空分辨率、增强的信背比和卓越的成像深度，使其成为复杂生物系统精确诊断的强大手段。与传统的“持续发光”探针不同，刺激响应型NIR-II荧光探针根据特定的生物目标靶向激活，在目标检测中具有更高的特异性和准确性。本文介绍了刺激响应型有机小分子近红外荧光探针的最新研究进展，强调了潜在分子设计策略、激活机制、以及在生物成像中的典型应用。
氧化还原响应型探针
氧化还原动态平衡对细胞的完整性至关重要，是维持关键的生理功能的基石。氧化还原动态平衡的失调与多种疾病密切相关，包括心血管疾病、癌症和慢性炎症。体内主要的氧化还原活性物种包括ROS、RNS和RSS。ROS由超氧化物(O2·—)、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)和单线态氧(1O2)等分子组成。RNS主要包括一氧化氮(NO)、过氧亚硝酸盐(ONOO—)和二氧化氮(NO2)，而RSS包括硫化氢(H2S)、谷胱甘肽(GSH)和多硫化物(H2Sn)。生理条件下，ROS和RNS通过酶和非酶抗氧化系统维持在低浓度。当这种平衡被打破时，过量的氧化剂会诱导氧化或亚硝化应激，导致细胞损伤、线粒体功能障碍和免疫功能失调。因此，监测这些氧化还原物种对于了解疾病机制和开发精确疗法至关重要。有机NIR-II荧光探针因其可控的光物理性质、对特定分析物的高响应性，为氧化还原成像提供了有力支持。在过去的十年里，新颖的分子设计使生命系统中氧化还原过程的实时、高分辨率可视化成为可能，推动早期诊断和治疗监测进步。
羟基自由基响应型探针
活性氧（ROS）中反应性最强的是•OH，特征是存在未成对电子且半衰期极短。体内•OH主要通过Fenton反应或在高能辐射（X射线和γ射线）作用下通过水的辐射分解产生。由于其极强的亲电性，•OH以接近扩散临界速率与脂质、蛋白质和DNA无差别反应，使其成为氧化损伤的强效介质。正常生理条件下，抗氧化系统和相关酶迅速清除•OH，使其浓度维持在可忽略的水平。•OH的过量产生与神经退行性疾病、心血管疾病、癌症和炎症的发病密切相关。NIR-II荧光成像通过减少自发荧光和光子散射，为深层组织成像提供内在优势，但NIR-II窗口内的•OH响应型探针近期才开始引起关注。首个用于检测•OH的近红外二区探针Hydro-1080，采用了一种新颖的分子设计，通过可逆地破坏和恢复荧光团的π共轭体系及结构刚性来实现荧光调整。Hydro-1080由于其非平面化学结构和较差的π共轭性，在可见光区域仅表现出微弱的吸光度，且缺乏荧光。Hydro-1080一侧C-N作为·OH的识别位点，被氧化为C=N，形成具有扩展共轭和平面结构的Et-1080，后者表现出强烈的NIR-II吸收和荧光。Hydro-1080暴露于·OH后恢复π共轭平面性，通过“关-开”激活机制重新激发NIR-IIa荧光(1300–1400 nm)。Hydro-1080实现了脂多糖(LPS)诱导的全身性炎症和对乙酰氨基酚诱导的肝毒性模型中·OH波动的动态成像。探针Hydro-1080具有独特的“NIR-II激发/NIR-IIa发光”特性，SBR显著提高至6.0，实现了病理刺激下肝脏•OH梯度高对比度可视化。
过氧化氢响应型探针
H2O2是肿瘤微环境(TME)中关键的信号分子，也是肿瘤细胞中含量最丰富的活性氧物质。在适当浓度下，H2O2通过氧化修饰调节多种蛋白质，包括转录因子中的氧化还原感应型半胱氨酸残基，从而激活或抑制下游信号通路。肿瘤中异常的血管系统、快速增殖和高代谢活性导致缺氧，进而触发缺氧诱导因子(如HIF-1α)的上调。H2O2通过抑制脯氨酰羟化酶进一步稳定HIF-1α，并增强其基因表达和翻译后修饰，形成加速肿瘤适应和进展的反馈回路。因此靶向检测和调控H2O2对癌症诊断和治疗至关重要，越来越多的H2O2响应型荧光探针已被用于生物成像应用。苯硼酸酯是最广泛使用的H2O2识别单元之一，一种基于七甲川染料的探针HP-H2O2被开发为肿瘤靶向H2O2响应型NIR-II荧光团，用于病理性H2O2水平检测。基团中引入吡啶基和在末端引入叔丁基，有助于抑制聚集体中的荧光猝灭，为苯硼酸酯键合创造位点。与H2O2反应后，硼酸酯部分发生裂解，释放出母体染料HP-N1，后者调控快速PET或ICT过程，恢复并增强其NIR-II荧光。HP-H2O2探针在急性炎症小鼠模型中显示出转化潜力。在脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）中，HP-H2O2探针的激活使肺部产生增强的荧光信号，这与组织损伤的严重程度相关。此外，在肾缺血再灌注损伤（IRI）模型中，静脉注射HP-H2O2不仅能够可视化肾脏损伤，还能反映损伤的严重程度。
苯并[1,2-c:4,5-c’]双([1,2,5]噻二唑)（BBT）是一种很有前景的构建单元，可用于合成具有D-A-D结构的π共轭窄带隙荧光团。然而其在水溶液中易发生聚集诱导猝灭，缺乏可激活响应。为解决这些局限性，设计了一种响应性纳米探针BTPE-NO2@F127。基于BBT赋予AIE特性实现H2O2检测。纳米探针BTPE-NO2@F127是通过将响应分子BTPE-NO2包裹在FDA批准的F127中构建而成。硝基苯氧乙酰胺部分作为H2O2响应单元，被触发前会猝灭。病理性H2O2水平下，硝基苯氧乙酰胺基团的裂解恢复共轭，导致吸收峰从615 nm红移至680 nm，NIR-II荧光(950–1200 nm)显著增强。荧光强度与H2O2浓度线性相关，并且对其他ROS表现高选择性。在间质性膀胱炎、曲唑酮诱导的肝损伤和肝脏缺血再灌注损伤（IRI）的小鼠模型中，BTPE-NO2@F127能够通过NIR-II FLI和多光谱光声断层扫描（MSOT）实现准确的病变定位。
次氯酸根/次氯酸响应型探针
次氯酸根离子（ClO—）是次氯酸（HClO）在生理pH条件下部分解离产生的一种高氧化性物质，在免疫中发挥着关键作用。中性粒细胞产生大量HClO清除入侵的病原体。然而，过量的ClO—生成会损伤宿主组织，导致炎症和退行性疾病。因此精确、时空动态监测ClO—对于理解氧化应激相关病理机制和开发有效治疗方法至关重要。目前开发了一种NIR-II比率型纳米探针DCNP@SETT@PEG来进行体内HClO成像。该双发射体系包括：(i)一种含硒荧光团SeTT，其带有噻吩基团，可发生氧化诱导π共轭断裂，且对HClO有响应；(ii)以1550 nm发射的掺铒上转换纳米颗粒核（DCNP）作为内部参照物。暴露于HClO后，SeTT在1150 nm处的荧光因氧化裂解而淬灭，而DCNP的发射保持恒定，通过I1150/I1550进行比率定量。探针DCNP@SETT@PEG可在多种疾病模型，包括肿瘤微环境、腹膜炎、关节炎和兔骨关节炎，进行实时成像，检测极限为0.4 μM，且响应迅速。类风湿关节炎(RA)是炎症性疾病中常见的慢性自身免疫性疾病，与过量产生HClO密切相关。设计了一种“关-开”NIR-II荧光探针PTA，用于对深部组织内早期RA的HClO成像。探针PTA基于D-A-D构建，利用吩噻嗪为核心。暴露于HClO时，吩噻嗪被氧化为吩噻嗪-5-鎓衍生物，吸电子能力增强，从而增强了ICT并激活了936和1237 nm的双通道荧光。探针PTA能够对类风湿关节炎模型中的内源性和外源性HClO进行实时成像，与对照组相比，炎症关节的荧光强度增加了4.3倍，证实了其在疾病早期诊断中的临床相关性。
NO响应型探针
NO是一种重要的内源性信号分子，参与血管扩张、神经传递和免疫调节。作为一种气态的“非经典”神经递质，NO在不需要受体的情况下很容易在细胞膜上扩散，能够调节突触活动和血管张力。在生理水平上，NO通过维持血压和血管内稳态发挥保护作用，从而预防心血管疾病。但NO水平的异常升高会破坏氧化还原动态平衡，导致氧化/亚硝化应激，加重炎症和其他病理。监测体液中的NO及其衍生物，特别是血清和肝脏中的NO，对肝脏炎症和氧化应激的监控提供思路。因此开发了一种NIR-II响应探针QY-N，用于非侵入性检测中药引起的肝损伤。探针QY-N具有典型的D-π-A结构，由双羟基单元作为电子供体，喹啉基团作为电子受体，丁胺基团减弱了喹啉接受电子能力，有效猝灭荧光。暴露于NO中，丁胺基团的N-亚硝基化引入了强吸电子的丁基-N-亚硝基单元，从而增强了ICT，导致红移吸收，从610 nm到700-850 nm，和强NIR-II荧光(910-1110 nm)。此外，二甲氧基苯胺基赋予AIE性质，使得聚集态能够产生强烈的荧光。结合NIR-II FLI和MSOT，可以精确、非侵入性地定位和量化肝脏损伤的严重程度。
鉴于NO在急性炎症部位的高表达，NO可以作为早期炎症反应的可靠生物标志物。由此开发了一种NO响应性探针HC-N，用于检测和成像急性炎症病变中的NO。HC-N的结构来源于七甲基菁支架，中心位置的仲胺作为NO识别单元。该胺的N-亚硝化反应将给电子体转变为电子引出基团，增强了ICT，使吸收峰从660 nm红移到865 nm，相应的NIR-II荧光发射从900 nm红移到1150 nm。此外，为了增强生物相容性，在HC-N中引入了亲水性的三甘醇链。在急性皮炎和关节炎的小鼠模型中，HC-N探针能够利用双模式NIR-II FL/PA成像检测NO，有助于准确诊断急性炎症。
ONOO—响应型探针
ONOO—是O2·—与NO反应生成的一种强氧化剂，具有很强的氧化和硝化反应活性。虽然它在生理水平上有助于免疫反应和氧化还原信号传导，但过量的ONOO—会诱导氧化/硝化应激，导致炎症、细胞损伤和各种疾病。为了能够在体内精确监测ONOO—，一种双重响应型的NIR-II探针PN910被设计出来，专门应用于膀胱炎和结肠炎的特异性成像。PN910结合了两种活化机制：(i)与H2O2和ONOO—反应的硼酸酯部分；(ii)在pH>7.4时通过醌甲基化物中间体由于pH依赖性而自降解。在静息状态下，硼酸酯掩蔽了ICT过程。当被目标分析物氧化裂解后，ICT被恢复，引发强烈的NIR-II荧光。在DSS诱导的结肠炎模型中，PN910在发炎的结肠组织比非发炎对照中的信号增强了10倍。此外，PN910已成功用于监测膀胱炎和结肠炎小鼠模型的炎症反应，其荧光与临床炎症标志物（如尿液和粪便中的白细胞计数及血红蛋白水平）密切相关。虽然羟基和氨基取代的荧光团已被广泛用于生物传感，但由于缺乏合适的结构，它们在刺激响应型NIR-II探针设计中的应用受到限制。ONOO—响应型荧光探针NIRII-HD5-ONOO—被设计用于体内炎症检测。用1,4-二乙基-十氢喹啉-苯并吡喃单元取代吲哚部分以红移荧光，并引入苯甲酸衍生物和吸电子基团来调控pKA和化学稳定性，被芳基硼酸酯掩蔽的酚羟基作为ONOO—反应单元。暴露于ONOO—后，硼酸盐发生裂解，释放出羟基并增强ICT效应。这种激活导致在895/936 nm处有很强的荧光，并在854 nm处恢复了吸收，表明“关-开”转变。探针NIRII-HD5-ONOO—显示出高特异性，并被成功地应用于淋巴炎症的活体可视化，与对照组相比，荧光信号增加了2倍。
H2S响应型探针
H2S是一种内源性气体信号分子，在血管扩张、神经传递和炎症反应的调节中起关键作用。在心血管疾病、神经退行性疾病等情况下，H2S水平异常，可以体现其作为诊断生物标志物的潜力。利用H2S的亲核和氧化还原特性设计探针。在目前实际应用主要包括三种反应机理：对亲电基团的亲核加成、保护基的硫解（例如2,4-二硝基苯基醚）以及硝基到胺的还原级联反应。这些方法有助于在复杂生物系统中实现具有更高时空分辨率的H2S选择性检测。检测H2S最常用的策略之一是H2S与缺电子的芳基卤化物之间的亲核芳香取代反应。基于这种方法，制备纳米探针NPs@BOD/CPT，用于富含H2S的结直肠肿瘤的诊断和按需光控制药物释放。该探针由H2S响应性小分子BODIPY染料InTBOD-Cl与临床使用的化疗药物伊立替康喜树碱-11（CPT-11）共同包封在温敏性纳米颗粒中。在H2S存在下，染料InTBOD-Cl上的氯原子与H2S发生亲核取代反应，生成InTBOD-SH。这种转变改变了染料分子的化学结构，导致其光学性质发生重大变化。反应前，InTBOD-Cl的荧光发射波长为588-599 nm。当转换为InTBOD-SH时，发生了显著的红移，进入NIR-II，荧光峰约为1000 nm。此外，InTBOD-Cl对H2S表现出高度的特异性，在GSH和半胱氨酸等其他硫醇的存在下没有观察到明显的光学响应。这种高选择性确保了在复杂的生物环境中对H2S的准确识别。这种NIR-II荧光成像方法可以对富含H2S的结直肠肿瘤进行准确诊断。利用H2S的亲核加成反应，基于精确检测的目的，开发了一种基于FRET的比率型NIR-II纳米探针FRHS，用于体内H2S精准测量。探针FRHS由两种NIR-II荧光染料组成：作为受体的H2S响应型七甲基染料LET-1055和作为供体的H2S非响应型罗丹明-杂化多亚胺染料Rh-930。RH-930在930 nm处发射，对H2S保持惰性，并提供稳定的参考。而LET-1055在1055 nm处表现出很强的NIR-II的荧光峰，并通过HS—对其苯并吡咯基团亲核加成，被H2S选择性猝灭，从而关闭了FRET过程。在无H2S存在的情况下，供体Rh930(λex=808 nm)向LET-1055传递能量，导致通道2(1000-1700 nm)有较强的荧光发射，而通道1(900-1000 nm)有较弱的荧光发射，并且信号比较低。当有H2S存在时，七甲基染料LET-1055被猝灭，增强了通道1中的供体信号，而降低了通道2中的受体信号。这种基于通道1与通道2的信号比的比率检测方法显著地减少了背景干扰。在原位肝肿瘤模型中，注射纳米探针FRHS后8 h，肿瘤面积信号比(通道1至通道2)是正常组织的5.8~6.5倍。肝损伤模型中，脂多糖（LPS）诱导的H2S上调使肝脏信号比提高了6.3倍，而S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）诱导的H2S水平激活使肝脏信号比提高了8.8倍。
GSH响应型探针
GSH是细胞氧化还原动态平衡的重要调节因子，在维持生理平衡方面具有双重作用。作为最丰富的细胞内抗氧化剂，GSH与谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)协同作用，将有害的过氧化物还原为惰性羟基衍生物，从而维持膜的完整性并抵御氧化应激。同时，谷胱甘肽通过动态巯基-二硫键交换调节免疫反应，调控炎症和细胞信号传导。这种自我再生的氧化还原循环支持GSH作为临床验证的生物标志物的重要性，其异常水平与肿瘤发病、肝功能障碍和神经退行性疾病有关。目前用于GSH传感的探针设计策略主要利用两个原理：(i)动态二硫键交换，即利用可逆的硫醇-二硫键平衡进行比率信号设计；(ii)亲核的硫醇反应：硫醇诱导的芳香族取代使不可逆的探针激活。基于这些原理，制备了用于肿瘤诊断和治疗的GSH响应型近红外光疗纳米平台IR-FEP-RGD-S-S-S-Fc。该多功能纳米平台集成了肿瘤靶向的环状RGDfK多肽、谷胱甘肽反应的三硫化物连接体和具有S-D-A-D-S结构的NIR-II荧光团IR-FE。在GSH水平升高的肿瘤特异性条件下，三硫键连接物被切割，释放二茂铁猝灭剂，抑制PET过程，从而激活荧光。值得注意的是，这项工作首次在S-D-A-D-S框架内对二茂铁介导的PET猝灭进行了实验验证，揭示了关键的距离依赖效应：将二茂铁到核的距离从1.2 nm减小到0.8 nm，猝灭效率提高了3.2倍。此外，水环境中的疏水相互作用促进了分子的紧密排列，进一步放大了猝灭和激活后的信号恢复。体内成像显示出高度肿瘤特异性，在注射低剂量(50 μM，100 μL)后12 h，SBR值达到8.6，从而使肿瘤区域的精确定位成为可能。二硫键(-S-S-)是谷胱甘肽激活的探针设计中常用的经典氧化还原响应基序。在以GSH浓度升高为特征的还原肿瘤微环境中，二硫键被裂解成硫醇基团(-SH)，从而实现治疗或诊断药物的受控释放。利用这一机制，开发了一种GSH响应型NIR-II荧光探针Tg-RGD，用于精确检测原位肿瘤和肝脏肿瘤。该探针结合了七甲基菁染料IR-806作为近红外荧光团，二硫键作为GSH响应单元，以及以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽为末端的聚乙二醇链，用于主动肿瘤靶向结合。在自然态下，Tg-RGD的荧光被猝灭。当暴露在肿瘤微环境中的高水平GSH时，二硫键断裂，分子内发生取代反应和结构重排，导致NIR-II窗口红移。在1.6 mM GSH作用下，Tg-RGD探针的NIR-II荧光强度增加了约50倍。在原位乳腺癌模型中，Tg-RGD探针能够在注射后1 h内清晰显示肿瘤和正常组织之间的界限，对比度在4 h时达到峰值。在肝转移模型中，Tg-RGD可促进转移灶的清晰可视化，实现SBR=3.2。
肿瘤微环境（TME）响应型探针
TME是一个复杂而动态的病理生理系统，由恶性细胞、间质成分(如成纤维细胞和内皮细胞)、浸润免疫细胞和非细胞成分组成(包括细胞外基质、细胞因子和代谢副产物)。这一特殊环境展现出独特的生化和生物物理特征，如代谢性酸中毒(pH=6.5-6.8)、低氧、间质液体压力(IFP)升高和粘度增加，这些特征与健康组织显著不同。这些特异性状不仅影响肿瘤的进展和治疗反应，而且还为肿瘤的早期检测、靶向成像和治疗监测提供了有前景的生物标志物。
pH响应型探头
实体瘤的一个特点是细胞外呈酸性，这是由糖酵解异常和血流灌注不良引起的。肿瘤和正常组织之间的pH梯度(ΔpH≈0.5-1.0)为靶向探针激活提供生化思路。PH响应型NIR-II探针通常含有对酸敏感的部分，如肼基键或叔胺，它们在响应pH变化时会经历可逆的结构或电子变化。这些变化改变了荧光团的ICT特性，使精确的、肿瘤特异性的荧光激发成为可能。一种pH响应的NIR-II荧光探针CEAF-OMe被开发用于肿瘤和炎症的活体成像。CEAF-OMe探针由NIR-II荧光团、炔丙基作为官能团的LYSO-1005和亲水性聚合物单元PEG组成。LYSO-1005中的哌嗪部分在酸性环境中发生质子化，抑制了ICT猝灭，并显著增强荧光强度。实验数据表明，pH=5.0时的荧光强度是在pH=7.0时的4倍以上，证实了其较强的酸敏性。CEAF-OMe探针在生理条件下形成猝灭的纳米聚集体，但在胞吞作用后靶向激活并保留在酸性溶酶体中。这种双重机制在溶酶体环境(pH 5.0-6.0)中导致108倍的荧光增强。活体成像显示，在给药后1 h内，肿瘤边缘迅速清晰显示，SBR≥10可持续长达36 h。
另一种pH响应探针DTTVBI NPs被设计为具有AIE性质的可逆NIR-II光敏剂，用于FLI引导的光疗。在两性DSPE-mPEG2000和PLGA的包裹下，DTTVBI自组装成水溶性DTTVBI NPs，使其能够在肿瘤中高效积聚。AIE的特点是聚集时荧光增强，在组织渗透深度高的条件下提供强大的NIR-II荧光。在pH为6.0~8.0的范围内，DTTVBI NPs的I415/I696比值与pH呈良好的线性关系，pKa=6.94。在酸性条件下(如肿瘤pH~6.5)，C=N键质子化，调节了分子内电荷转移（ICT）并促进了系间窜越，从而增强了荧光和光动力疗效。在取自患者的异种移植(PDX)小鼠模型中，DTTVBI NPs能够进行高分辨率的NIR-II FLI和有效的光疗，同时在中性环境中自我失活，减少对健康组织的脱靶损伤。
低氧响应型探针
低氧是实体肿瘤的一个特征。这是由细胞快速增殖和血管结构紊乱导致的氧供需失衡引起的。这种缺氧环境引起缺氧诱导因子的稳定，特别是HIF-1α，它协调了一系列适应性响应，包括血管生成、代谢重编程、免疫逃避和治疗抵抗，这为肿瘤特异性成像和治疗提供了有价值的目标。肿瘤缺氧的一个关键生物标志物是硝基还原酶(NTR)，这是一种在低氧条件下催化硝基芳香化合物生物还原的还原酶。利用这一特征，开发了第一个NTR响应NIR-II荧光比率探针Rap-N，使肿瘤内不同的氧气水平可视化。RAP-N由罗丹明6G衍生的供体和一个由硝基苯桥联的聚甲炔受体组成。在低氧肿瘤微环境中，NTR介导的硝基还原诱导了1,6-消除反应，改变吸电子连接体，使发射峰从940 nm移动到1010 nm。这种比率漂移(I1000/I940)使肿瘤氧化作用的动态和定量成像成为可能。体内研究表明，Rap-N探针在实体瘤中提供了可靠的低氧分层，其发射曲线与氧水平相对应，从而有助于识别侵袭性缺氧区。为了提高诊断和治疗的实用性，通过包裹荧光染料BN-O和血管干扰剂康普瑞汀磷酸(CA4P)，设计了一种低氧响应性治疗纳米探针BC@Z-M，进入多功能递送系统。在探针BC@Z-M中，BN-O是一个含N-氧化物的低氧敏感荧光团，而CA4P是一种选择性地破坏肿瘤血管的血管干扰剂。这两种试剂都被装载到一个pH可降解的ZIF-8 MOF中，并被巨噬细胞衍生的膜包裹起来，以实现免疫逃避和归巢能力。在低氧条件下，BN-O的N-氧化物部分被还原为N，N-二乙基苯胺，在氮原子上有一个孤电子对，使分子从受体-受体(A-A)结构转变为D-A结构。这增强了ICT，荧光显著红移到约900 nm。在低氧刺激下，710/900 nm处的吸收/荧光强度呈时间依赖性增加，NIR-II荧光信号增强112倍。在4T1荷瘤小鼠模型中，直接在肿瘤内给药BC@Z-M探针导致肿瘤组织中的荧光明显高于健康对照组。在低氧刺激下，该探针同时进行NIR-II FL和PA成像，显示出强大的诊断缺氧性肿瘤的潜力。
粘度响应型探针
粘度是生物系统的一种基本物理性质，已成为疾病诊断中一个敏感且未被充分探索的生物标志物。病理过程，如癌症、肝损伤和心血管疾病，常常伴随细胞内或细胞外粘度的改变。粘度升高限制了分子的旋转和构象自由，影响了分子扩散、信号传递和酶动力学。这些变化可用于利用分子转子进行荧光激活，其发射特性直接受微环境黏度调节。
肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)是肝脏外科手术后的严重并发症。其病理过程涉及缺血性损伤和炎症介导的再灌注损伤两个相互关联的阶段，这可能引发广泛的细胞毒性反应和器官功能障碍。因此，开发能够精确定位HIRI的有效诊断工具具有重要的临床意义。一种新型粘度响应型NIR-II荧光探针NP-V被开发出来，用于体内标记肝脏损伤部位并指导手术切除。在低粘度环境中，如胞外液或细胞质区域，探针NP-V中的可旋转单键和激发态C=C键促进了非平面构象的形成。这种分子旋转扭曲了NP-V荧光团的π共轭结构，激发态能量通过内转换非辐射通道和系间窜越得到释放，导致荧光猝灭。当NP-V进入高粘度环境，如溶酶体或细胞外基质的病变区域时，可旋转的单键和激发态的C=C键变得刚性，限制分子内旋转(RIR)。这种限制恢复了NP-V的π共轭，防止非辐射衰变的能量耗散，导致荧光的显著增强。当介质粘度从3 cP增加到460 cP时，探针NP-V的荧光强度增加了13倍，在甘油中表现出相对较高的FLQY，为0.34。在HIRI小鼠模型中，肝区NP-V的荧光强度明显高于正常小鼠，SBR=3.7。NP-V能够在体内标记肝脏损伤区域，有效指导手术切除损伤组织，具有显著的临床应用潜力。
另一种具有AIE特性的粘度响应型NIR-II荧光探针DPXBI被开发出来，实现肝损伤早期影像无创诊断。通过双键将给电子的二苯胺基团连接到吸电子的苯并吲哚磺酸盐骨架，从而构建DPXBI。苯并吲哚磺酸盐部分由于其固有的刚性和旋转能力，也具有分子转子的功能。这种结构不仅促进给电子，还提供了分子内旋转自由，这对粘度响应至关重要。在低粘度环境中，连接两组分和二苯胺基团的双键自由转动，允许激发态能量通过非辐射衰变消耗，导致DPXBI荧光猝灭。随着粘度增加，这种分子内的旋转受到限制，导致荧光的恢复，引发以911 nm为中心的发光大幅增加。DPXBI在粘性介质中表现出近10倍的荧光增强。在活体实验中，DPXBI成功地应用于HIRI小鼠模型，有效可视化HIRI，并显示了损伤部位增强的空间异质性。这些发现凸显了该探针检测早期肝损伤以及以高空间精度指导外科手术的能力。
酶响应型探针
酶是生物体中分布广泛的一类功能蛋白质，具有催化效率高、底物专一性强等特点。它们能以高效靶向催化几乎所有的生理过程和代谢反应。酶异常表达或功能失调往往与肿瘤和各种重大疾病的发展密切相关。
酶响应型NIR-II荧光探针的开发通常利用底物和酶之间的特定反应。碱性磷酸酶(ALP)是一类重要的水解酶，广泛存在于哺乳动物组织中。它的主要功能是催化磷酸酯键水解，从而在体内的各种代谢过程中发挥重要作用。但在肝损伤等病理条件下，ALP往往显著上调，表现为肝组织及周围区域异常过表达。在此基础上，设计了一种荧光探针TTX-P，用于糖尿病肝损伤的NIR-II荧光原位检测和成像。TTX-P中TTX-OH作为荧光染料，磷酸部分作为响应基团。TTX-OH荧光团由含噻唑丙二腈受体的三苯胺和苯基呫吨供体组成。这种D-A结构保证了TTX-OH染料发出NIR-II荧光。不与碱性磷酸酶反应时，TTX-P的磷酸基团起到强吸电子基团的作用，抑制电子供应，导致微弱的荧光信号。肝损伤时，ALP明显过表达。TTX-P中的磷酸基团被ALP催化水解，转化为羟基，从而释放出荧光团TTX-OH。这一过程增强了TTX-P的给电子能力，导致荧光信号显著增强。由于酶的高度选择性，TTX-P被ALP特异性激活，且响应迅速，能够对小鼠肿瘤和糖尿病肝损伤进行荧光成像，SBR约为5。乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是一种主要位于肾小管上皮细胞溶酶体中的溶酶体酶。在肾脏损伤期间，溶酶体膜受损，导致NAG释放到细胞外间隙，随后排泄到尿液中。因此尿液中NAG水平升高是检测肾损伤的重要生物标志物。在此基础上，设计了一种由NAG激活的智能NIR-II荧光纳米探针BOD-II-NAG-NP。BOD-II-NAG-NP探针是由BOD-II-NAG与高分子载体mPEG-DSPE自组装而成，BOD-II-NAG将BODIPY染料与NAG结合。当NAG酶与探针BOD-II-NAG-NP接触时，NAG酶能特异性识别和降解探针中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖残基。水解后，探针进一步发生1,6-消除反应，释放出具有NIR-II荧光BODIPY染料BOD-II-NAG-SH。分子的NIR-II荧光BOD-II-NAG在1000 nm波长处显著增强，检测极限为0.72 mU mL-1。BOD-II-NAG只对NAG酶有反应，荧光强度在pH =6-10范围内保持稳定。通过药物诱导的AKI小鼠模型和糖尿病肾病小鼠模型的体内成像实验，BOD-II-NAG-NP探针对NAG酶表现出高度特异性和灵敏响应性。
双刺激响应探针
虽然单刺激激活探针具有很高的灵敏度和特异度，但生物系统本身就很复杂，常常表现出重叠或波动的微环境信号。为了提高靶向准确性和减少假阳性，双刺激反应探针已经成为整合两种不同病理响应整合到一个分子系统中的强大工具，如氧化还原失衡、pH变化、低氧或酶过度表达。这些逻辑门控探针通常采用“与”逻辑设计，荧光只有在同时识别两个刺激物时才被激活，提供精细时空控制和卓越成像精度。设计并合成了一种双刺激响应荧光探针BOD-NH-SC，它能够同时监测细胞内NO和H2S的动态变化。探头BOD-NH-SC的核心结构包含两个独立响应模块。N-甲基-2-甲氧基苯胺基作为NO敏感单元，通过S-亚硝化反应，与NO特异结合，生成N-亚硝基产物BOD-NO-SC，缓解PET效应，645 nm的近红外荧光发射被激活，荧光强度增加214倍。4-硝基苯硫醇-BODIPY结构作为H2S的响应域。根据亲核芳香族取代反应机理，H2S用α-SH取代硝基，生成BOD-NO-SH，导致吸收光谱显著红移，并引起936 nm处的NIR-II荧光，FLQY=0.06 %。该探针可通过H2S引发的转亚硝化反应可逆地释放S-NO，再生BOD-NO-SH，恢复NIR-II荧光。当再次引入NO时，S-亚硝化反应重新开始，实现了荧光信号在红区(~645 nm)和NIR-II(~936 nm)之间的多次循环切换。高粘度和高H2O2水平是肿瘤微环境的显著特征。基于这些特征，一种名为BX-B的双响应NIR-I/II荧光探针被设计用于早期肿瘤监测和成像。在H2O2存在下，BX-B中的硼酸酯部分发生反应生成BX-OH，释放出NIR-I荧光信号。同时，羟基的产生显著提高了光动力疗法和光热疗法(PTT)疗效。在肿瘤微环境等高粘度环境中，BX-B的荧光进一步放大，并伴随着NIR-II荧光。值得注意的是，只有同时具备H2O2和高粘度条件时，才能观察到NIR-II荧光显著增强，从而将假阳性信号降至最低。由于PDT和PTT诱导的细胞死亡导致粘度增加，BX-B被用来评估肿瘤细胞的治疗反应。在140 μM H2O2和高粘度条件下，BX-B的NIR-I(810 Nm)和NIR-II(945 Nm)的荧光强度分别增加了27倍和8.2倍。在粘性环境中，荧光强度与H2O2浓度在1.0~140 μM范围内呈良好的线性关系，对NIR-II荧光信号的检出限为0.37 μM。体内肿瘤模型展示实际应用中该探针能进行有效的肿瘤治疗，并通过NIR-II FLI实现了对治疗结果的实时监测。
肿瘤微环境还表现出低pH值和高H2O2水平。利用这些特点，设计了一种pH/H2O2双响应NIR-II荧光探针HN-PBA，用于肿瘤成像和术中导航。HN-PBA以BODIPY荧光团为基础，在H2O2和酸性肿瘤微环境中被激活。硼酸酯基团是H2O2的特异性识别位点。在H2O2存在下，发生反应，生成含有硫醇的BODIPY，从而恢复和增强ICT，并释放NIR-II荧光信号。羧酸修饰的罗丹明衍生物作为第二个锁，通过pH依赖的螺环反应机制进一步增强了荧光信号。在H2O2(500 μM)和酸性条件(pH 6.5)下，HN-PBA的NIR-II荧光信号显著增强约17.1倍。HNPBA的荧光与H2O2浓度呈线性关系，检测极限为1.2 μM。HN-PBA在小鼠模型中表现出良好的NIR-II荧光检测性能，其SBR在注射后24 h达到峰值，对于原发肿瘤和肺转移瘤分别达到24.3 %和6.4 %。
其他响应性探针
除了上述常见的靶向生物标志物外，其他与生物和环境相关的物质，如重金属离子、疾病特异性蛋白和某些代谢中间体，可以作为激活NIR-II荧光探针的刺激物。这些靶点扩大了响应性成像系统在疾病诊断、毒理学和神经退行研究的适用性。
汞离子(Hg2+和MeHg+)是剧毒重金属，有独特器官靶向特征。为了能够实时、无损监测汞在体内累积，开发一种NIR-II响应荧光探针NIR-Rh-MS。其利用了罗丹明染料经典的螺内酰胺开环机理，并结合硫代氨基甲酰脲部分，用于选择性识别Hg2+/MeHg+。暴露于任一形式的汞时，螺环断裂，恢复π共轭体系，并在1015 nm处触发强烈的荧光“开启”信号。Hg2+和MeHg+的检出限分别为40 nM和1.14 μM。Hg2+(0-15 μM)和MeHg+(0-300μM)的荧光强度分别增加了24倍和23倍。在体内，FLI证明了NIR-Rh-MS探针能够区分汞诱导的器官毒性：剧烈暴露于Hg2+(20 mg kg-1)的小鼠肝脏荧光增加8.1倍，而MeHg+(15 mg kg-1)能够穿过血脑屏障，导致脑荧光显著增强。这些结果验证了NIR-Rh-MS可以作为实时监控汞毒性分布和研究动力学的强大工具。
淀粉样蛋白-β(Aβ)斑块是阿尔茨海默病(AD)的标志，与大脑中错误折叠的蛋白质聚集和神经退行性变密切相关。为了满足早期和非侵入性诊断AD的需要，设计了一系列基于D-π-A架构的NIR-II荧光探针，并对其在体内检测Aβ斑块的能力进行筛选。在这些候选分子中，DMP2与Aβ纤维的结合亲和力最高，通过抑制扭曲分子内电荷转移（TICT）实现荧光激活。在水溶液中，DMP2探针以TICT状态存在，并保持不发射。当与Aβ纤维结合时，TICT被抑制，允许DMP2转变为高发射局部激发(LE)状态。这种结构转换使NIR-II的荧光强度提高了41.8倍。此外，DMP2表现出良好的光学穿透性，可以通过1.5厘米厚的组织检测到NIR-II信号。由于其良好的亲脂性和血脑屏障渗透性，DMP2在AD模型小鼠脑内迅速蓄积，并在注射后10 min内观察到强烈的荧光信号，并可持续60 min检测。AD模型小鼠的荧光强度是野生型对照小鼠的1.5倍，证实了DMP2探针对Aβ斑块的特异靶向作用及其在阿尔茨海默病病理高对比度NIR-II FLI中的实用性。
结论
刺激响应型NIR-II荧光探针在特定的生物条件下通过“关-开”机制发出荧光。与其他成像方法相比，它们在正常组织中表现出低背景信号，并提供更高的时空分辨率和对比度，使其成为生物成像中的一种新兴模式。有机刺激响应型NIR-II荧光探针，包括小分子和半导体聚合物在内的物质，因其精确的结构调控，已被广泛用于NIR-II荧光成像。这些探针通过结构变化对特定的刺激做出反应。与传统的“持续发光”探针不同，可激活的NIR-II探测器具有包括“关-开”、“开-关”和比率计量模式等响应类型。通常采用两种分子设计策略：一种是构建带有响应性功能基团的有机分子，这些基团能与目标生物标志物发生特异性反应；另一种是开发功能性两亲聚合物基质，将这些响应性基团嵌入或共价接入聚合物骨架中。这种靶向特异性的激活能够实现信号精确时空控制，极大地提高了深层组织FLI中的SBR和空间分辨率。由AIE、FRET、PET和ICT等机制调制的探针已经实现在活体荧光成像方面取得突破，成像深度达到几毫米。与传统的NIR-I探针相比，这些响应型NIR-II探针SBR显著提升，检测更加高效和准确，并具有强大的临床潜力。
参考文献
Stimuli-responsive organic small-molecule NIR-II fluorescent probes，Ziyang Zhang, Anqing Mei, Weili Wang, Kang Xu, Minqi Wang, Peng Chen, Jinjun Shao, Xiaochen Dong, Coord. Chem. Rev. 545 (2025) 217026,https://doi.org/10.1016/j.ccr.2025.217026
