内容提要
线粒体功能的监测和调控对疾病的治疗具有重要的研究价值。小分子荧光探针由于其各种优点，包括无创性，上级灵敏度和实时反馈，已成为研究线粒体结构和功能的有力工具。本文综述了荧光探针的典型响应机制，包括光诱导电子转移（PET）、福斯特共振能量转移（FRET）、分子内电荷转移（ICT）等，并介绍了三苯基膦、吡啶、罗丹明衍生物等荧光探针的靶向策略，重点介绍了近年来发展起来的以酶、活性氧、粘度等为靶点的荧光探针，并对高性能小分子荧光探针的设计进行了展望。
本文首先总结了小分子荧光探针的响应机理，有助于理解当探针中加入分析物时荧光信号发生变化的原因，以及如何根据分析物和响应模式设计有效的分子，然后根据阳离子的不同，报道了靶向荧光探针的策略，包括三苯基膦（TPP+）、吡啶、罗丹明衍生物、吲哚衍生物等，特别是近年来发展起来的以酶、活性氧（ROS）、粘度、pH等为分析对象的荧光探针。
荧光探针的响应机制
一般设计的荧光探针可以由三部分组成，包括识别单元（接收器），信号单元荧光探针在生物学、化学、荧光探针对分析物的响应机制是通过经由荧光探针的荧光信号引起荧光信号的变化来实现的。探针与特定分析物的相互作用。当游离探针与分析物结合时，发生光物理过程，导致荧光现象的变化（激发/发射波长、量子产率、荧光强度、荧光寿命等）。常见的响应机制包括光诱导电子转移（PET）、福斯特共振能量转移（FRET）、分子内电荷转移（ICT）、激发态分子内质子转移（ESIPT）、聚集诱导发射（AIE）、振动诱导发射（VIE）、荧光团内部结构变化等，全面深入地了解其工作机理有利于荧光生色团的设计和制备。
光诱导电子转移（PET）
PET是指分子在光激发下发生的电子转移，按电子转移方向可分为受体激发的PET（a-PET）和供体激发的PET（d-PET）两种类型。基于PET的探针包括三部分：当识别基团响应分析物时，如果PET效应有限，则荧光被打开如果PET效应被激活，则荧光信号被关闭。Podsiadhoy等人已经报道了次氯酸探针，NBD-TM，这是一个典型的基于PET的探头。硫代吗啉单元与7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑（NBD）的连接可以通过PET机制有效抑制荧光。硫代吗啉的氧化阻止了PET过程，在550 nm处产生绿色荧光。Hu等报道了三种具有三种识别位点的二乙基氯膦酸酯（DCP）探针MZOH、MZN和MZNN 。MZNN以邻苯二胺为识别基团，可与DCP相互作用，抑制PET过程，并且在500 nm处产生强荧光信号。
荧光共振能量转移（FRET）
FRET是一种非辐射能量转移过程，通过供体和受体之间的长程偶极-偶极相互作用进行工作。在光激发之后，来自受激供体的电子激发能量可以转移到基态受体。供体单元的发射光谱和受体单元的吸收光谱之间存在重叠，供体和受体单元之间的合理距离约为10-100 nm 。例如，Ooyama等人报道了基于PET和FRET的水探针，其中蒽-以（氨甲基）苯基硼酸酯为PET型供体荧光团，并且BODIPY骨架被用作DJ-1的FRET过程中的受体荧光团。对于中性态供体单元，有一对来自氮的电子，水的加入打破了PET过程，导致体系中出现两个荧光团，FRET过程被激活，发射光谱位于508 nm处。
分子内电荷转移（ICT）
分子内电荷转移（ICT）效应一般指具有给体-受体（D-A）结构的小分子。这些探针通常表现出溶剂化显色性。在极性变化很大的溶剂中，探针会表现出不同的共振形式，从而影响其吸收和荧光光谱。当探针与分析物发生响应时，识别基团的给电子和吸电子性质可以改变，导致吸收和发射光谱的移动。ICT效应可以与其他响应机制有效地结合。例如，Lin等基于ICT和FRET的结合合成了亚硫酸氢盐荧光探针。对于探针ZFPy，ICT在通过双键连接的氨基苯基和苯并[e]吲哚啉衍生物之间具有活性。两个荧光团的存在导致FRET的发生，HSO 3-/SO 32-的加入使分子中的双键转变为单键，ICT受到抑制，ICT的破坏导致受体荧光团消失，FRET不连续，最终在光的激发下，供体荧光团在475 nm处产生荧光发射，与此相反，Lian等人报道了一种基于ICT机制的“off-toon”效应的荧光探针，其中香豆素衍生物被用作供体荧光团，萘酰亚胺衍生物被用作受体荧光团。在加入多硫化氢之前，ICT被破坏，没有FRET响应，产生香豆素诱导的473 nm发射。
聚集诱导发射（AIE）
传统的发色团在稀溶剂中溶解时是发射的，但随着聚集体的形成，出现聚集导致的猝灭（ACQ）现象。相反，对于某些发色团，荧光随着浓度的增强而增强，即AIE 。这一现象是由Tang的团队于2001年首次发现的。其机理是基于分子运动的限制，包括限制分子内旋转（RIR）和限制分子内振动（RIV）。例如，螺旋桨形的四苯乙烯（TPE）在稀溶液中不发光;然而，在聚集态，由于RIR，它变得高度发光。除了RIR机制，一些稠环分子也显示AIE现象，这不能用分子内旋转的限制来解释。在这种情况下，它被解释为分子内振动的限制。图4a中的壳状发光体THBA在稀溶液中不发光，并且在聚集态，由于RIV效应，它变得高度发射。分子结构的微小变化可能会影响聚集态的荧光性质，Niu等发现meso-噻唑探针1由于其自由旋转和细胞器靶向能力而显示出AIE现象和粘度传感特性。具有C-N双键的内消旋咪唑探针2证明了AIE现象，而对粘度响应不明显，含饱和硫原子的meso-苯并噻吩探针3对粘度有响应，而meso-苯并吡咯探针4没有表现出粘度和AIE的传感特性，因此，结构的微调有助于分析结构与性能的关系，为新型分子结构的研究提供新的思路.四苯乙烯（TPE）是一种典型的AIE染料，其分子结构简单易修饰，在多个领域具有广阔的应用前景，Fang等报道了以TPE为AIE基团的过氧亚硝酸根（ONOO−）荧光探针。探针MeOTPE-NO2不发荧光。加入ONOO-可以将MeOTPE-NO2转移到MeOTPE-NH 2，该探针在聚集状态下在505 nm处显示出强烈的荧光发射。与其他活性氧和氮物种相比，该探针对ONOO−表现出突出的特异性，以及低细胞毒性。
振动诱导发射（VIE）
AIE依赖于分子聚集来实现发光。在聚集态，分子内振动受到限制，抑制了非辐射能量耗散，从而增强了荧光。VIE不依赖于聚集，即使在单分子状态下也可能发生，VIE现象是由Tian和Chou首先发现的，2015年DPAC的中心核是一个柔性的环状8π电子环二氢吡嗪，导致V形多环骨架，苯和菲之间存在空间位阻，导致弯曲态形式，最低激发态（S1）的激发态芳香性反转可能导致平面振动到平面振动。有趣的是，随着温度和粘度的变化，荧光光谱发生了很大的变化。从弯曲状态到平面状态，DPAC的发射光谱发生了红移，结构转变引起了较大的Stokes位移，这种非常规的异常大的Stokes位移被称为VIE 。这些独特的性质为生物传感器和生物成像领域的发光材料的设计打开了一扇新的大门。例如，Huang等人设计了一种基于DPAC的探针Q1。它可以响应蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP 1B）。处于自由振动状态的探针可以发出红光。当探针与磷酸酶反应时，响应基团转移到羟基，在450 nm处荧光增加。荧光团3显示“固定”振动状态，Li等人基于VIE基团设计了一种粘度响应探针DPAC-DY。在非粘性状态下，探针显示出弱的黄色荧光。而粘度的增加会导致黄色发射。在高粘性状态下，有强烈的黄色发射。综上所述，VIE效应发生在单分子态，由分子内振动驱动。这些振动引起不同电子激发态之间的耦合，最终导致发光。VIE现象发现于大约十年前。除了肤浅的现象理解外，更多的努力，如理论计算和实验方法的见解，应该进一步探索，以可视化复杂的激发态行为。
激发态分子内质子转移
ESIPT是通过烯醇（E）-酮（K）四能级光互变异构反应实现的（E → E* → K* → K →...）显示在图中。（OH，-NH 2）至受体（-C=O，-N=）伴随着氢键的嬗变，产生了大的Stokes位移，这激发了许多新的光电应用。ESIPT受许多因素的影响，如温度，pH值，溶剂极性，Chen等报道了一种基于ESIPT机理的过氧化氢（H2 O2）荧光探针HBQ-B。对于HBQ-B，在365 nm激发下，ESIPT没有响应，荧光光谱位于538 nm。H2 O2的加入可以氧化探针并消除苄基。此外，所得烯醇可以通过互变异构转化为酮，在422 nm的激发波长下产生大的斯托克斯位移（234 nm），具有显著的检测限（40.2 nM）ASIPT是指氢键的转化以及杂原子和氢的合适的空间排列。
荧光团的内部结构变化
除了质子转移引起的烯醇（E）-酮（K）互变异构外，其他一些形式的变化也会影响荧光信号，罗丹明衍生物在无色螺环形式之间表现出质子驱动的平衡（封闭形式）和荧光两性离子形式（开放式），Urano等人设计了一系列自发闪烁的荧光团。例如，当HMRG以两性离子形式存在时，它在500 nm处显示吸光度，在523 nm处显示荧光，而质子的加入可以将开放形式改变为封闭形式，使荧光信号消失。Tang等人报道了一种光驱动的可转化光学试剂，DTE-TPECM。在用365 nm光照射5 min后，ROpen-DTE-TPECM可转化为其闭环异构体（RClosed-DTE-TPECM），在650 nm左右有一个新的吸收峰，开环异构体的发射光谱位于550 nm左右，这种有趣的光开关性质为荧光可视化/光动力学疗法开辟了新的思路。总之，探针的质子化或光激发可以引发开环或环化反应，导致荧光团的结构发生变化。这个过程改变了探针的共轭结构，因此，质子和光子可以作为设计高性能荧光探针的优良激发动力。
靶向线粒体的探针策略
线粒体是细胞中重要的细胞器，被公认为细胞的“发电站”，除了通过合成ATP产生能量外，还参与许多其他重要的细胞生物学活动，如调节细胞凋亡、维持Ca 2+稳态、产生活性氧等。线粒体功能障碍与人类多种疾病密切相关，如图8a所示，线粒体从外到内分为四个部分：线粒体外膜（OMM）、线粒体膜间隙（IMS）、线粒体内膜（IMM）和线粒体基质（MM）。与克雷布斯循环活性相关的氧化还原转化导致线粒体膜电位（Δ Km），它可用于储存ATP合成所需的能量。Δ m的值约为− 180 mV，其异常水平可引发多种病理。线粒体膜电位负是转运阳离子的驱动力，可用于设计和组装靶向基团。线粒体探针的常见结构包括三部分：靶向基团、荧光团和反应位点（图8b）。由于线粒体内膜上质子梯度诱导的负电位，正电荷单元被用作线粒体识别单元，如三苯基磷（TPP+）、吡啶鎓、罗丹明衍生物、吲哚鎓衍生物等，反应位点响应于细胞中的不同因素，包括酶、活性氧（ROS）、pH、粘度等。
三苯基膦阳离子靶向单元
三苯基膦阳离子（TPP+）是一种广泛使用的线粒体靶向单元，可被线粒体高效特异性摄取，探针进入基质需要穿过质膜和线粒体膜，电位分别为30-60 mV和150-180 mV ，膜电位可提高探针的浓度水平，37 ℃时浓度与电位之间的关系。由于电位的存在，线粒体基质中阳离子的浓度约为细胞外浓度的100至1000倍。例如，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）及其磷酸酯（NADPH）对ATP的产生至关重要，Lee等报道了一种基于TPP+的靶向NAD（P）H探针，用于区分癌细胞和正常细胞。对于探头1，TPP+被用作线粒体-探针1无荧光。NAD（P）H的加入可使吡啶基团还原为中性的π共轭体系，在pH 4-10范围内，荧光团中的ICT效应被激活，在615 nm处产生强荧光，具有高选择性。TPP+具有较大的空间位阻，常作为侧链引入到探针中。
吡啶鎓阳离子靶向单元
Hu等合成了一种基于三苯胺的探针PDTPA，用于检测线粒体中的次氯酸盐，其中吡啶鎓以单键直接连接到主链上。探针以三苯胺为供体单元，吡啶盐和二氰基乙烯基为受体单元，并以吡啶盐为线粒体靶向基团，二氰基乙烯基能与ClO−发生反应，在630 nm处有微弱荧光，ClO−的加入使二氰基乙烯基被去除，在540 nm处有较强荧光，吡啶阳离子在整个反应过程中稳定。Zhang等设计了一种深红色比率探针MXMP，用于检测线粒体中的过氧亚硝酸盐。对于MXMP，荧光光谱位于660 nm处。ONOO−可以去除吡啶鎓，并产生醛基，导致530 nm处的荧光，发射位移高达130 nm。MXMP的检测限仅为84 nM。总之，当吡啶阳离子作为荧光靶向基团时，除了靶向基团外，它通常有助于电荷转移，影响荧光光谱分布。
罗丹明靶向基团
罗丹明是荧光探针中广泛使用的染料，既可作为靶向基团，又可作为荧光团单元，Lemasters等研究了罗丹明123的光谱和代谢特性，以追踪离体大鼠肝线粒体的跨膜电位，线粒体内外的探针浓度比约为4000：当罗丹明123的浓度超过检测这些光谱位移所需的水平时，它抑制ADP诱导的线粒体呼吸，以及倒置的内膜囊泡和部分纯化的F1-ATP酶的ATP酶活性，因此，罗丹明探针可以被线粒体高效摄取以监测荧光变化，而线粒体ATP酶的抑制可能是探针细胞毒性的原因。Lin等报道了一种以罗丹明为靶向基团和荧光团的苯基取代咪唑基罗丹明探针RV-1。在低粘度环境中，RV-1没有荧光，因为转子的旋转限制了ICT效应。然而，增加的粘度可以抑制转子的旋转，具有改进的ICT过程和在655 nm处的强荧光。Zhong等人设计了喹啉融合的罗丹明开启探针，RQB-R，用于检测SO2衍生物。由于PET效应，探针是非发射性的。HSO 3 −可以引发喹啉4位的1，4-亲核加成反应，并将探针的A-π-A结构改变为D-π-A结构，增强ICT效应，Hu等基于对硝基苯基氧代乙酰罗丹明合成了一种靶向荧光探针RhB-NIR。由于PET效应，RhB-NIR没有荧光。H2 O2可以将仲胺转移到伯胺，探针显示140 nm的高斯托克斯位移和61 nM的低检测限（LOD）。总之，若丹明显示出靶向荧光的能力和荧光发射性能。
吲哚鎓靶向单元
吲哚鎓及其衍生物，如苯并[e]吲哚鎓和苯并[cd]吲哚鎓，也可以用作靶向基团，例如，Li等人报道了一种探针NFL 1，用于监测半胱氨酸水平，其中苯并[e]吲哚鎓被用作靶向基团，由于半胱氨酸在生物系统和线粒体过程中起着至关重要的作用，因此丙烯酸酯基团被用作半胱氨酸（Cys）的反应位点。除靶向基团外，苯并[e]吲哚鎓也参与了PET过程。对于NFL 1，PET效应活跃，荧光信号关闭。然而，Cys加成到丙烯酸酯基团中的双键上形成中间体T1，然后通过胺对羧基碳的亲核取代发生闭环反应，该探针具有灵敏度高、选择性好、检测限为14.5 nM的特点，在生物学领域具有广阔的应用前景。Liu等人设计了一种一氧化氮探针NFL-NH 2，其中2，3-二氢-1H-氧杂蒽被两个NH 2-基团修饰。在苯并[e]吲哚鎓和2，3-二氢-1H-咕吨-6，7-二胺之间存在强ICT，在780 nm处发出荧光，NO可诱导环化反应生成三唑，生成的NFL-NFL 1和NFL-NH 2中的线粒体靶向的苯并[e]吲哚不参与化学反应，Fan等报道了一种用于检测与铁中毒相关的多硫化氢的探针Mito-S4（H2Sn，n > 1）成像。该探针具有与NF-OH相似的结构，并在740 nm处显示荧光发射。当将H2Sn加入到探针溶液中时，H2Sn与苯并[e]吲哚鎓之间可发生亲核加成反应，与NFL 1和NFL-NH 2不同的是，Mito-S4参与了化学反应。
其它靶向单元
除上述四种靶向基团外，其他阳离子由于其正电位也可作为靶向基团，如Feng等以喹啉盐为靶向单元合成了双态发射型线粒体粘度探针MQP-Boc，在稀溶液和聚集态下均能显示荧光。在低粘度状态下，没有荧光，并且增加的粘度可以抑制连接喹啉鎓和氨基苯基的桥的旋转，Zhang等人还基于苯并噻唑鎓-咕吨体系设计了一种粘度敏感探针BTX，其中苯并噻唑鎓用作靶向单元。随着粘度的增加，690和750 nm处的荧光增强约14倍。与此不同的是，一些带有两个正电荷的线粒体识别探针已经被成功设计出来，如Meng等合成了一种双盐荧光探针Mito-FCC，用于线粒体NADH的识别，其中苯并[e]吲哚鎓和喹啉鎓都具有正电荷。喹啉鎓部分也被视为NADH识别单元，它可以被NADH还原。当它被NADH还原时，由于ICT效应，580 nm处的荧光强度增加。尽管喹啉被还原到中性状态，但探针仍然具有可靠的生物靶向能力。Yang等人基于罗丹明-半花青体系设计了一种pH探针Rh-NorCy，其中TPP+用作靶向组。当pH值降至5.8时，吲哚鎓 N原子质子化形成阳离子，导致吸光度从568 nm红移至709 nm，并在748 nm处显著增强荧光。此外，Peng等人设计了一种不对称五甲川花青染料Cy5.5-H-CyN，用于监测线粒体自噬中的pH波动，在那里，氮杂吲哚被用作针对大麻的单位。苯并[e]吲哚鎓作为末端基团参与共轭结构中的电荷转移，探针显示出窄而尖锐的随着pH值的降低，菁染料在近红外区的吸光度急剧下降，526 nm处的吸光度逐渐升高，在710 nm处的荧光减弱，在488 nm处的激发下，菁染料的荧光峰位于662 nm处。
TPP+、吡啶鎓、罗丹明、吲哚鎓衍生物等阳离子都可以作为靶向基团，但它们在具体应用中表现出不同的性质，TPP+通常作为烷基链或侧链，很少参与ICT、FRET等生物物理过程，相反，吡啶鎓可能参与ICT过程，吲哚鎓及其衍生物也可能是荧光团，吲哚衍生物可在中性状态下转移到强给体单元上，以检测质子的变化，罗丹明可作为质子的靶向单元和荧光单
线粒体靶向探针的研究进展
线粒体靶向活性氧探针
ROS通过低水平修饰磷酸酶和代谢酶，调节信号转导和转录，在维持正常细胞内环境稳定方面发挥重要作用，同时ROS还可损伤核酸、蛋白质，引起脂质过氧化，导致高水平的铁凋亡。ROS包括多种种类，如超氧阴离子自由基（O2 ·−）、过氧化氢（H2 O2）、次氯酸（HClO）和过氧亚硝酸盐/过氧亚硝酸（ONOO-/ONOOH）。活性氧与几乎所有人类疾病有关，包括癌症、帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）等中枢神经系统疾病、癫痫和抑郁症;呼吸系统疾病，如肺炎和哮喘，以及急性肺损伤;消化系统疾病，如药物性肝损伤、肝缺血-再灌注损伤和炎症性肠病;泌尿系统疾病，如急性肾损伤和膀胱炎;以及其他疾病如糖尿病、动脉粥样硬化（AS）和骨髓增生异常综合征。因此，设计检测这些疾病的探针对人类的健康具有重要价值。ROS主要产生于线粒体，线粒体是受线粒体钙离子（Ca2+）影响产生ATP和ROS的细胞器。
线粒体靶向超氧阴离子自由基（O2 ·−）探针
O2 ·−是最主要的活性氧，它可以转化为其他活性氧，如在超氧化物歧化酶（SOD）的催化下转化为H2O2，或与NO反应生成ONOO-等。O2 ·−主要在线粒体中产生，O2 ·−水平异常会引起多种疾病。因此，设计合适的靶向O2 ·−的荧光探针具有重要意义，Zhou等设计了一种双光子荧光探针V-OS，通过连接二乙氨基苯和二苯基次膦酸酯改性的吡啶。该探针可以响应粘度和超氧自由基阴离子。探针有微弱的荧光，粘度增加可以导致在625 nm处的红色发射。此外，Hua等设计了一种以N，N-二甲基苯胺为给体单元，吡啶鎓为靶向单元的探针DMPS-O，和二苯基次膦酸酯作为O2 ·−识别基团。与V-OS相比，由于在桥上引入了噻吩，因此具有更长的共轭长度。在与O2 ·−反应后，该探针在635 nm处显示出增强的荧光，具有217 nm的非常大的斯托克斯位移。James等人还报道了基于二苯基次膦酸酯的探针HMDP，以香豆素作为荧光团，和喹啉阳离子作为基于ICT效应的线粒体靶向单元。由于强烈的ICT效应，HMDP在714 nm处显示出荧光光谱。与O2 ·−反应后，由于二苯基次膦酸酯识别基团被去除，导致中等的ICT效应，在714 nm处的荧光强度降低，而在570 nm处的荧光增强了25倍。除了二苯基次膦酸酯作为O2 ·−识别基团外，三氟甲磺酸酯基团也是常用的O2 ·−响应基团，例如，Feng等人合成了双通道靶向探针DQ-CF 3，用于检测O2 ·−、极性和粘度。在DMSO中，KO 2产生超氧阴离子。探针几乎没有荧光，加入O2 ·−可以去除三氟甲磺酸基团，Chen等人报道了一种超氧阴离子探针Bcy-OTf，其中以苯并吲哚菁染料为骨架，三氟甲基磺酰基部分作为O2 ·−识别单元。探针最初有微弱的荧光。O2 ·−可以去除识别基团并形成羟基。-由于Bcy-OH中的OH具有较强的供电子能力，基于ICT效应，在619 nm处产生了较强的荧光，该探针的LOD值很低，仅为20 nM，响应时间短（<6 min）。Mao等设计了一种超氧阴离子可激活的近红外荧光探针QL-3F，其中喹啉鎓-咕吨骨架用作荧光团，三氟甲磺酸酯单元用作O2 ·−识别基团。三氟甲磺酸酯基团可以抑制ICT过程，QL-OH在690 nm处没有荧光，而O2 ·−的加入使QL-OH的羟基释放，荧光强度Stokes位移约为110 nm，DFT计算表明QL-OH的带隙比QL-3F小，偶极矩比QL- 3F大。
除了单通道响应通道外，Tang等人还设计了顺序激活的双通道探针DHX-SP，用于观察超氧阴离子（O2 ·-）和过氧亚硝酸根（ONOO-），其中喹啉-氧杂蒽骨架为荧光团单元，三氟甲磺酸根基团作为O2 ·-响应单元，苯硼酸基团用作ONOO−识别基团。该探针起初不显示荧光。O2 ·−可释放羟基并在710 nm处产生红色荧光。然后，ONOO−可以去除DHX-P中的苯硼酸基团，在560 nm处产生绿色荧光。此外，基于上述探针的结构修饰也在进行中，例如Tian等人合成了双光子荧光探针MC-O-TBS。
以汞代染料为荧光团，（三氟甲基）苯磺酸衍生物作为识别部分。与三氟甲磺酸酯基团相比，三氟甲基被双三氟甲基取代。O2·−与探针反应，在800 nm激发下，在557 nm处发出绿色荧光，荧光强度增强160倍，检测限为49.3nM。
线粒体靶向过氧化氢（H2O2）探针
H2O2在许多氧化反应中起关键作用，是生物生理、衰老和发病机制中的重要分子信使，可参与细胞增殖、迁移和分化。H2O2由NADPH氧化酶复合物活化产生，线粒体是产生H2O2的主要细胞器。H2O2的浓度从10− 9到10− 4 M不等，较高的浓度可能导致细胞内氧化应激和细胞凋亡。例如，脑内H2O2水平的异常与神经退行性疾病如帕金森病密切相关，癌细胞通常比正常细胞浓度高，基于此，科学家设计了不同种类的H2O2探针来检测H2O2，进而诊断多种疾病。Kong等设计了一种以吩噻嗪衍生物为供体、吡啶阳离子为电子受体和靶向基团、硼酸苄酯为反应位点的探针Mito-GM。加入H2O2可以氧化吡啶鎓阳离子，产生具有强分子内电荷转移（ICT）的中性D-π-A结构，Yu等人设计了一种基于吡啶酮-芘的探针Pyp-B。由于PET效应，在465 nm处有微弱的荧光。H2O2使苄基硼酸酯氧化生成荧光团Pyp，在625 nm处出现新的荧光峰。在低粘度环境中，由于单键的自由旋转，TTPB以扭曲的分子内电荷转移（TICT）状态存在，当粘度较高时，TICT受到限制，在666 nm处有有效的共轭结构和荧光;此外，H2O2可导致芳基硼酸脱保护生成苯酚，Hai等人报道了一种探针TPP-HCy-BOH，以硼酸（BOH）作为反应位点，半花菁（HCy）染料作为荧光团和光声（PA）荧光团，TPP作为靶基团。由于HCy的笼状羟基，ICT受到抑制，H2O2可以去除BOH部分并释放游离的HCy。所得的具有回收的ICT的化合物在100 ℃时打开FL信号。Li等人设计了一种三重响应探针VPH- 5DF，通过双NIR通道监测H2O2、粘度和极性。加入H2O2可以增加650 nm处的发射峰。此外，在低粘度环境中，当粘度增大时，（0%甘油）到高粘度环境（90%甘油），在750 nm处的荧光强度增加了38倍，当极性从低极性1，4-二氧六环增加到高极性水时，Yu等合成了一种探针，Mito-Bor，由于偶氮BODIPY具有近红外荧光和上级光化学稳定性。添加H2O2可以去除硼酸频哪醇酯以形成苯酚并打开荧光开关。
线粒体靶向次氯酸（HClO）探针
HClO是ROS家族的重要成员之一，是吞噬过程中产生的强氧化剂，在免疫系统中可作为病原体的“杀手”。通常，HClO是通过髓过氧化物酶（MPO）介导的吞噬溶酶体中氯离子的过氧化作用产生的，在吞噬溶酶体中病原体被分解。HClO可修饰脂蛋白，调节脂蛋白途径，调节细胞凋亡，并因其氧化能力而成为抵抗细菌和病毒入侵的免疫活性因子。与正常细胞相比，HClO水平通常在病变细胞中过表达，过量会导致一些疾病，如心血管疾病、关节炎和癌症。因此，因此，寻找一种合适的、简便的方法来直观地监测线粒体内HClO的含量具有重要的意义。Yin等报道了一种以苯并噻唑为端基的探针NSSN，在探针溶液中加入HClO后，双键被氧化，形成醛基，伴随着670 nm处的荧光信号减弱和540 nm处的荧光信号增强Dutta等人报道了一种探针AHS，用于检测HSO 3 − /SO 3 2−和ClO−，其中苯并[cd]吲哚鎓被用作靶向基团，-C= C键和-SMe基团被用作HSO 3 − /SO 3 2−和ClO−的识别基团，分别加入HSO 3-/SO 3 2-可引发迈克尔加成反应，将双键转化为单键，导致480 nm处的荧光信号增强，666 nm处的荧光信号下降。加入ClO-可将-SMe基团氧化为-S（O）Me，该探针具有选择性好、灵敏度高、水溶性好、抗干扰能力强等特点，为诊断类风湿关节炎（RA）等炎症性疾病，Xu等报道了一种以Hc-HClO为靶点的荧光探针。探针有弱ICT效应，伴有弱荧光。HClO可氧化探针并释放Hcy-OH，该探针对HClO的检测限低（14 nM），响应时间快（5 s），在585 nm处有较强的荧光Lu等人报道了一种比率荧光探针Mito-Rh-S，其具有阳离子罗丹明衍生物作为荧光团和靶向单元，以及2-甲氧基吩噻嗪作为HClO识别基团。对于探针Mito-RhS，a-PET效应是活跃的，抑制荧光发射。当HClO加入到探针中时，Mito-Rh-S探针中的2-甲氧基吩噻嗪被氧化成亚砜形式，抑制了PET效应，从而提高了680 nm处的荧光强度，该探针响应时间快（2 s），检测限低Liu等人报道了一种HClO激活的“关闭”靶向探针，NIR-ClO，用于骨关节炎诊断。探针在740 nm处显示荧光，而加入HClO可引发C-C双键的断裂，导致对HClO的荧光“开-关”响应，响应时间快（<60 s），检测限低（28.3 nM）。Ren等人报道了一种双响应荧光探针FDOCl-N-Na，用于检测H2 O2和HClO，其中4-硼酸酯-1，8-萘酰亚胺作为H2 O2的识别单元，乙二胺连接的亚甲蓝衍生物对HClO敏感。当将H2 O2加入溶液中时，在548 nm处有绿色荧光，而当将HClO加入探针溶液中时，该探针在690 nm处发出红色荧光，反映了H2 O2和HClO氧化能力的差异，其中HClO的氧化能力强于H_2O_2。该探针为设计能以不同氧化能力响应活性氧的新型探针提供了新的思路。Zhou等报道了一种探针，PI-Py，基于PET效应。在加入HClO之前，由于吩噻嗪单元的PET效应，没有荧光。加入HClO可以将吩噻嗪转化为亚砜形式，PI-Py对ClO−的选择性优于其它活性氧，Pu等人报道了一种基于香豆素的探针HDCl，其以季铵化吡啶鎓为靶向基团，N，N-二甲基硫代氨基甲酸酯（DMTC）作为HClO识别位点。加入HClO可以去除识别位点并形成苯酚。所得具有强ICT效应的化合物HDOH在641 nm处显示出强荧光信号，此外，HDCl探针具有超快响应特性（<5s），检测限低至2.8nM。Song等报道了一种基于BODIPY的双响应探针dfBDP，监测生物体中的F−和HClO水平。F-可以将硫醚转移到硫醇化合物dfBDP-F，具有增强的ICT效应，导致在940 nm处的荧光。而HClO可以将硫氧化为亚砜，抑制ICT过程，dfBDP-F和dfBDP-ClO在570 nm处产生荧光，荧光峰与荧光峰没有重叠，dfBDP探针响应快，灵敏度高，对F-和HClO的检测限分别为316.2 nM和33.9 nM。
靶向线粒体的活性氮（RNS）探针
RNS是另一类参与细胞内生殖、细胞通讯、激素调节等活动的反应性物质，包括一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO2）、硝酰基（HNO）、和过亚硝酸根（ONOO−）NO可由一氧化氮合酶（NOS）内源性产生，可作为一种神经递质，抑制血小板聚集，HNO是NO的质子化形式，而ONOO−是由NO和O2 ·−产生的。RNS在生物系统中表现出许多特性，如高反应性、短寿命、短瞬变特性（~毫秒）和低丰度（nM-μM）。这些特性对RNS的快速检测提出了巨大挑战。设计了不同类型的探针来克服这些挑战。
线粒体靶向NO探针
NO是生理过程中重要的生物标志物，在血管舒张、神经传递、抗肿瘤活性、抗病活性、呼吸和消化系统等过程中发挥重要作用。NO主要通过诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和L-精氨酸（LArg）催化产生，而iNOS主要在线粒体中产生，NO的异常表达可导致关节炎、动脉粥样硬化等疾病，因此，设计靶向NO的探针来监测NO水平具有重要价值。Su等基于七甲川菁结构，以吲哚为端基，以胺为NO响应部分，设计了一种靶向NO的探针Cy-OMe。探针没有荧光，NO可以触发N-亚硝化反应，Han等还合成了一种以4-甲基苯胺取代的异佛尔酮为荧光核心的荧光探针IPN，TPP+作为目标单位。由于分子内电荷转移（ICT）效应，探针在656 nm处显示荧光峰。当NO与探针反应时，由于ICT效应的限制，发射峰移到547 nm。Zhang等还设计了一种NO探针，BPTQ，通过探针与NO之间的N-亚硝化反应。首先，由于供体和受体单元之间的PET效应，探针显示出可忽略的荧光强度。NO可以与氨基反应形成N亚硝基化合物，该探针的检测限为15 nM，响应时间小于30 s。除了亚硝化反应外，NO还可以引起环化反应，导致荧光的变化，如Zheng等报道了一种靶向细胞的荧光探针MTNO，用于细胞和组织中NO的可视化在MTNO中存在伯胺，由于苯胺和萘酰亚胺之间形成了六元重氮环，NO的加入使457 nm处的荧光强度增加了约430倍。此外，Lin等报道了一种基于环化反应的菁探针Mito-NO，其中伯胺作为给电子基团，菁作为电子受体单元。由于ICT效应，在510 nm激发下，探针在594 nm和771 nm处产生荧光，NO的加入可形成五元环并使吲哚阳离子转移到中性状态，这减弱了伯胺与吲哚基团之间的ICT效应，抑制了两个吲哚基团之间的ICT，导致荧光强度显著降低。
线粒体靶向过氧亚硝酸根（ONOO−）探针
ONOO−通过NO和O2 ·−之间的非酶反应形成。它与质子化的ONOOH平衡存在（pKa为6.8），在pH为7.4时半衰期短（~1 s）。它表现出一系列性质，包括氧化，亲核行为，以及转化为高活性二级自由基（如· OH和· NO2）的能力。ONOO−参与许多生理过程，如细胞内信号传导和氧化还原稳态，正常水平有利于生物功能的发挥，但由于其强氧化能力和亲核性，过量生产会氧化和硝化核酸、脂质和蛋白质等生物活性物质，导致许多疾病，如神经退行性疾病、炎症、心血管疾病、由于线粒体是细胞的发电站，也是ROS产生的主要来源，因此更容易产生过量的ONOO−，并遭受ONOO−的氧化损伤。Zhang等报道了一种基于ICT的荧光探针Mito-NA，用于监测过氧亚硝酸盐水平。向Mito-NA溶液中加入ONOO-可以去除3-由于增强的ICT过程，454 nm处的荧光降低，而558 nm处的荧光增加。Wu等人设计了一种探针，TPTT，用甲基苯并噻唑-卟啉共轭。ONOO−可以切断连接甲基苯并噻唑鎓和卟啉的双键，导致在670 nm处的荧光开启过程。Dong等人报道了一种基于蒽环的探针。ONOO−，作为亲核试剂，可以攻击探针并破坏共轭骨架，在628 nm处的荧光强度降低。Guo等人设计了一种基于ICT的荧光比率探针，DMANI。对于香豆素半花青体系，存在分子内电荷转移（ICT）效应，而ONOO-与双键之间的加成反应可引起明显的荧光信号从红色变为蓝色，692 nm处的荧光强度降低，444 nm处的荧光强度增强。Hu等人报道了一种探针BC-PN-2，具有二氰基乙烯基苯并吡喃色酮共轭结构。 ONOO−可以破坏二氰基乙烯基并产生在520 nm处具有强荧光的醛基。丘吉尔等人报道了一种苯并吲哚菁荧光探针，BICBzBF。对于探针，ICT过程被抑制，ONOO−的加入可切断芳基硼酸酯，生成具有增强ICT效应的醛，且在Shuang等人报道了一种用于检测粘度和ONOO-1的多功能靶向探针P-1。在高粘度下，存在受限的旋转，该探针可用于基于扭曲内电荷转移（TICT）的粘度变化的检测而芳基硼酸酯的引入对ONOO-有响应作用，ONOO-的加入可使芳基硼酸酯的ICT效应增强，在570 nm处有较强的荧光等人设计了一种双通道荧光探针QX-DP，其中喹啉作为靶向单元，二苯基次膦酸酯作为ONOO−识别单元，双键作为粘度识别基团。对于QX-DP，ICT效应关闭，并且存在弱荧光。ONOO−的加入可以去除二苯基次膦酸酯并释放QX-OH，在752 nm处产生显著的“开启”荧光信号。对于QX-DP，预期其以TICT状态存在，引起激发态的非辐射延迟，没有/弱荧光发射。但高粘度会限制旋转并限制TICT效应，导致在668 nm处产生强荧光。Fu等人还设计了双响应探针WD-2，用于监测ONOO−和粘度，其中吲哚鎓阳离子作为靶向单元。在高粘度环境中，由于TICI效应受到抑制，它在620 nm处显示出高荧光。ONOO−的加入可能导致双键断裂，导致在525 nm处产生强荧光。
线粒体靶向粘度探针
细胞粘度也是反映细胞健康与否的重要微环境参数，它可以影响许多生理活动，如生化反应、分子和蛋白质的运输、电子传递、膜结构等，线粒体基质中的异常粘度与许多疾病的发生有关，如阿尔茨海默病（AD）、因此，设计靶向动脉粥样硬化和肿瘤的粘度响应探针对于这些疾病的诊断具有相当大的价值。Liu等报道了一种基于苯并噻唑的荧光探针HBTD-V，用于可视化和监测线粒体中的粘度。对于HBTD-V，由于单键的旋转，在低粘度环境中存在弱发射，但高粘度可能限制单键的旋转，Zhu等人通过C-C双键将萘酰亚胺与苯并[e]吲哚鎓连接，构建了一种探针NV。在高粘度介质中，由于限制了苯并[e]吲哚鎓转子的旋转，635 nm处的荧光发射增加了106倍。Dong等人报道了一种探针POTA-OH，以对羟基二苯胺基取代的氧杂蒽部分为给体，吡啶阳离子为受体。随着粘度水平的增加，在720 nm处存在值得注意的荧光“开启”信号，这是由于限制的旋转和抑制的TICT。另外，探针POTA-OH在635 nm激光照射下能产生有效的活性氧，Zhou等报道了一种通过将苯并[e]吲哚鎓与4-甲基-1，4-二氢吲哚连接而成的粘性荧光探针NIR-V，二甲氨基肉桂醛。当粘度较低时，苯并[e]吲哚鎓和氨基苯基可沿着单键旋转。在高粘度水平下，旋转受到抑制，该探针在700 nm处显示出高度灵敏的荧光光谱响应。Shu等人报道了一种基于TICT的荧光探针（IDQL）来检测粘度，以吲哚衍生物为靶向基团，久洛利定为给电子基团。 TICT机制在高粘度环境中依赖于受限的分子旋转。在低粘度环境中，由于自由旋转和非辐射延迟，存在弱荧光。粘度的增强可以限制旋转。
线粒体靶向pH探针
酸碱平衡在细胞生存、增殖、分裂、凋亡、离子转运、能量产生等不同的生理病理过程中起着至关重要的作用，正常细胞有一个稳定的pH值或范围，它还与细胞内的细胞器有关，如细胞质pH约为7.2，细胞外pH为7.4，线粒体的pH值约为8.0，溶酶体的pH值为4.5-5.0，高尔基体的pH值为6.0-6.7 。异常的pH值范围会打破体内平衡，导致许多疾病，如代谢紊乱，神经退行性疾病，甚至癌症。线粒体是细胞的能量工厂，它们参与氧化还原反应和细胞凋亡的启动。线粒体维持碱性环境，质子可以通过呼吸电子传递被挤出内膜。这个过程提供质子动力，通过H+-ATP合酶产生ATP。pH稳定性的破坏会产生ROS，如超氧化物，过氧化氢等，从而影响相关的生物活，因此，设计合适的探针监测线粒体环境中pH的变化具有重要意义。Lin等人设计了一种基于苯并噻唑盐的荧光探针NBO，用于检测基于ICT和TICT效应的pH波动和粘度响应。随着pH的变化，酚羟基和酚氧阴离子之间发生结构转换。探针在532 nm处显示黄色发射。当pH从4增加到10时，NBO分子中的C-C双键发生了旋转，导致了TICT过程的发生，降低了NBO分子的荧光强度;粘度的增加抑制了TICT过程的发生，Luck等报道了半花菁荧光探针用于线粒体pH的监测。随着pH值的变化，探针和质子化探针之间存在构象变化，结果表明，探针B的荧光强度随pH的增加而增强，当pH为3.2时，荧光强度主要位于693 nm处，随着pH的增加，693 nm处的荧光强度逐渐减弱，而739 nm处的荧光强度逐渐增强。上述两种探针是基于羟基与氧阴离子之间的相互转化而设计的。Guo等人设计了一种比率pH探针CouDa，以吲哚-香豆素融合骨架为荧光团，用于监测功能障碍线粒体的酸化过程。在酸性环境中，发射峰主要位于658 nm处。而在碱性条件下，OH−可引发加成反应，破坏大的共轭结构，James等人设计了一种多功能探针来跟踪线粒体中的pH、HSO 3-和粘度，其中羟基苯基1，3-苯并恶唑作为pH识别单元，苯并[e]吲哚用于粘度响应，桥中的C-C键被用来响应HSO 3-。当pH为3时，苯并恶唑被质子化，ESIPT和ICT效应被抑制，当pH从3增加到9时，质子被移除以形成具有ESIPT效应的羟基苯基1，3-苯并恶唑，并伴随着在445 nm处的新峰。有趣的是，当pH从9继续增加到1,3时，结果表明，随着溶液粘度的增加，445 nm和605 nm处的发射峰逐渐增强;加入HSO 3-后，HSO 3-可与C-C双键发生反应，由于HSO 3-的共轭作用被破坏，ICT效应被抑制，导致在445 nm处的发射峰。
线粒体靶向生物分子探针
线粒体靶向酶探针
酶是能够催化生化反应并影响生理和生物过程的蛋白质大分子，酶与疾病密切相关，酶的表达和活性水平异常可引发多种疾病。在生命系统中有许多酶调节稳态，如氧化还原酶、核酸酶、肽酶、翻译后酶、酯酶和糖苷酶。氧化还原酶包括氧化酶，如酪氨酸氧化酶、单胺氧化酶（MAO）等，以及还原酶，如硝基还原酶（NTR）、硫氧还蛋白还原酶（TrxR）等。在病理细胞中，某些酶通常过表达。例如，缺氧或低氧水平，NTR是肿瘤组织快速增殖和代谢异常引起的致病特征，NTR能还原芳香族硝基化合物，在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的帮助下，在缺氧环境中，NTR经常过表达。因此，氧化还原酶在维持人体平衡中起着关键作用，异常水平可用于区分不同疾病。核酸酶可修饰DNA并调节肿瘤表达，如激酶、甲基转移酶、糖苷酶、磷酸二酯酶等，蛋白酶如半胱天冬酶（Cas）、亮氨酸氨肽酶（Leucine aminopeptidase，APN）等也能反映疾病的水平，如APN在恶性肿瘤的生长繁殖中起重要作用，APN的异常水平可导致许多疾病。翻译后酶，如蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP），碱性磷酸酶（ALP）等，在调节核酸和染色体的结构中很重要。例如，ALP可催化单磷酸的脱磷酸化，ALP的异常水平与骨质疏松、胆道梗阻、AD等疾病有关;酯酶可催化酯水解为醇和酸的反应。它有助于生理和病理过程，如基因表达，酯代谢，信号转导调节和解毒。此外，酯酶在药物靶标和前药激活剂的设计和合成中起着至关重要的作用。在癌细胞中，糖苷酶催化糖苷键的水解，如β-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶等，参与碳水化合物的消化、糖缀合物的溶酶体催化和糖蛋白的翻译后修饰。因此，蛋白酶已成为最重要的蛋白酶之一。亮氨酸氨肽酶（Leucine aminopeptidase，VAP13）主要表达于肝脏和肾脏，与肝炎、乳腺癌、卵巢癌、肝癌等疾病密切相关。探针存在自由旋转，导致低荧光强度。然而，粘度的增加会限制旋转，导致700 nm处的荧光显着增强。另一方面，LAP可以消除识别基团，引发600 nm处的荧光爬升。产生的中间体VLAPF可以进一步响应极性。当极性增加时，荧光从非极性甲苯中的489 nm红移到水中的612 nm。
线粒体DNA（mtDNA）和RNA（mtDNA）探针
mtDNA，存在于线粒体中，是一种闭环双链结构，含有遗传信息，在线粒体能量代谢中起关键作用线粒体DNA的损伤可导致线粒体嵴断裂、线粒体膜破裂、线粒体膜损伤等严重后果，线粒体形态改变、膜电位降低甚至细胞死亡，因此，设计mtDNA探针监测细胞健康对检测母体遗传性疾病具有重要意义。Zhang等报道了三种不同连接体长度的双萘酰亚胺探针用于监测线粒体损伤，三种探针的主要发射峰位于约625-637 nm，短波长发射很弱。当探针溶液中加入mtDNA后，长波长的荧光强度基本不变，而短波长的荧光强度有不同程度的增强，特别是含有长连接基的NaN 6- OH，其453 nm处的荧光强度增强了8.2倍，NaN 6-OH折叠强烈，探针与mtDNA的相互作用可产生非堆积结构，Tang等设计了一系列基于吲哚地戈酮的探针，使用不同的供体单元来显示线粒体DNA G-四链体，（mtDNA G4）水平。对于具有二甲基氨基苯基作为供电子基团的探针ISAP，当探针溶液中加入c-Myc DNA G4后，在702 nm处的荧光强度急剧上升，表明ISAP具有良好的线粒体靶向能力，可实现mtDNA G4的荧光成像。线粒体中mtDNA含量很低，对灵敏度要求很高，而且mtDNA的损伤会降低荧光探针的灵敏度和准确性，因此，Xu等设计了一种用于实时检测mtDNA损伤的线粒体迁移探针MCQ。对于游离的探针，有微弱的荧光，并且mtDNA可以在570-600 nm处增加荧光强度。当损伤的mtDNA释放探针时，MCQ与核DNA（nuDNA）的结合使探针再次具有更强的荧光，核-线粒体信号比成像显示出明显的优势，如与线粒体DNA损伤正相关、超高灵敏度等。除了mtDNA外，mtDNA也是检测线粒体损伤的重要生物标志物，Wang等设计了一种以mtDNA为靶点的探针SYN，用于追踪线粒体的迁移. SYN的发射非常微弱，加入DNA或RNA可使430-490 nm处的荧光强度分别增强99倍和113倍。它能很好地靶向线粒体，对于正常线粒体，探针能与线粒体联合收割机结合，线粒体损伤释放探针，探针能与RNA结合进入核仁，最终照亮核仁，实现线粒体损伤的监测.
线粒体靶向ATP探针
ATP主要产生于线粒体，是细胞内的能量来源，在能量传递、DNA复制、生物合成等许多生命活动中起着关键作用，ATP水平的波动可能与许多疾病有关，如炎症、PD、癌症等，因此，ATP是这些疾病的重要指标，设计检测ATP水平的探针对相关疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。Wang等设计了一种基于硼酸基团的荧光探针TPA-P4，以吡啶为ATP靶向基团，硼酸基团为ATP识别单元，三苯胺为聚集诱导发射（AIE）基团，用于监测线粒体内ATP的波动。此外，三苯胺也是给电子基团，而吡啶鎓是吸电子单元，其可以形成具有良好分子内电荷转移（ICT）的D-π-A结构。TPA-P4在620 nm处不发荧光，而ATP浓度的增加使荧光强度增强，探针中的硼酸可以通过脱水与ATP联合收割机，并且探针带正电荷，而ATP带负电荷，导致TPA-P4与ATP之间发生静电吸附，因此，ATP与TPA-P4之间的静电相互作用形成聚集态，由于AIE效应而产生强荧光，通过ATP成像，该探针可以区分正常肝细胞（LO 2）和肝癌细胞（HepG 2），显示出对肿瘤诊断的显著潜力。Cao等报道了一种基于FRET效应同时检测ATP和谷胱甘肽（GSH）的香豆素连接四苯乙烯荧光探针P1，其中香豆素为FRET供体荧光团，四苯乙烯为FRET受体单元，二硫键用于指定GSH，而吡啶鎓酰胺阴离子位点用于识别ATP。由于FRET效应，P1在633 nm处有微弱的荧光，ATP与P1之间的静电相互作用导致四苯乙烯荧光团的AIE效应，GSH可切断二硫键，破坏FRET效应，使供体荧光团在467 nm处产生荧光。
线粒体靶向NADH探针
NADH是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的还原形式，是生物体必需的辅酶，主要存在于线粒体中，发挥其在线粒体功能、抗氧化、能量代谢、钙平衡等方面的优势，其水平异常可反映疾病，如PD、癌症等。因此，实时监测NADH水平可以增强我们对疾病进展的理解。Wang等报道了一种检测NADH水平的探针QB，其中喹啉阳离子和苯并[cd]吲哚作为靶向基团，喹啉阳离子作为NADH识别单元。探针首先显示出A-π-A结构，并且作为还原剂的NADH可以攻击喹啉阳离子并将其转移到中性状态，该探针在686 nm处的荧光强度随NADH浓度的增加而逐渐增强，响应时间在6 min以内，具有良好的上级选择性和灵敏度，检测限为43 nM。Liu等人合成了一种基于罗丹明的探针，用于检测NADH，其中喹啉阳离子既是靶向基团又是NADH识别基团。当探针被NADH还原时，螺内酯构型从封闭形式变为开环，DFT计算表明，若丹明单元和喹啉单元之间的排列更加平面化，π-离域性得到改善。Zhang等设计了一种双响应荧光探针来监测NAD（P）H和线粒体粘度，其中NADPH是NADH的磷酸酯对于探针3Q-2，喹啉鎓用作靶向基团和NAD（P）H识别基团，丙二腈用作吸电子单元，乙烯用作接头，当3Q-2被NAD（P）H还原时，喹啉转移到给电子的烯胺上，形成了具有改善的分子间电荷转移（ICT）效应的D-π-A结构。另外，随着粘度的增加，由于TICT效应受到抑制，550 nm处的荧光强度显著增强，当粘度较低时，喹啉和丙二腈发生旋转，3Q-2激发态的能量在非辐射过程中耗散，高粘度抑制了旋转，限制了TICT效应，从而提高了荧光强度。
线粒体靶向生物硫醇
探针氨基酸是肽和蛋白质的基本构建单位。它们还在代谢过程和生理调节中起作用。线粒体是细胞的动力工厂，线粒体中含有多种氨基酸，参与机体代谢、抗氧化等生理过程，其氨基酸水平的异常可以反映线粒体的活性，因此监测线粒体中氨基酸水平对肾脏相关疾病的诊断具有重要意义。我们以半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）为例，分析相关探针及其工作机制。生物硫醇在生理过程中起着关键作用，异常水平会导致疾病，如艾滋病、PD、癌症等。肝损伤初期线粒体爬升Wang等报道了一种以苯并[e]吲哚为靶向基团的半胱氨酸靶向探针SY-Cys，以丙烯酸酯基为Cys识别单元。丙烯酸酯基团可以抑制ICT效应，并且探针在630 nm处显示出非常弱的荧光。Cys中的巯基可以被迈克尔加成到丙烯酸酯基团上，由于ICT效应，SY-OH在630 nm处的荧光增强，探针响应时间快（4 min），灵敏度高Wang等人报道了一种探针XA，用于监测Cys水平，其中氯取代的四氢吖啶盐用作Cys识别基团，并以氧杂蒽基团为供体单元。通过用Cys取代探针形成产物。探针中的Cl原子由于其电子吸收能力而被硫原子取代，随着Cys浓度的增加，830 nm处的荧光强度明显增强。有趣的是，Hcy和GSH的加入并没有改善830 nm处的发射，这是因为Hcy和GSH没有发生胺和巯基之间的取代反应，因此探针显示出良好的选择性。
线粒体中的GSH是一种抗氧化防御生物分子，可以防止有氧代谢引起的氧化损伤，但GSH水平的异常会导致肝损伤、皮肤病、癌症等疾病。Cao等设计了一种基于萘酰亚胺的荧光探针TPP-Naph-SS-Fc，以萘酰亚胺为荧光团，以二茂铁为猝灭基团，二硫键为反应位点，以TTP+为靶向基团。起初，由于二茂铁引起的PET效应，探针无荧光，GSH与探针的相互作用可消除荧光猝灭。（a）探针Q B的结构及其对NADH的响应。（B）探针A的结构及其对NADH的响应。探针3Q-2的结构及其对NAD（P）H和粘度的响应。Liu等报道了一种基于四氢吖啶盐-香豆素体系的半胱氨酸/同型半胱氨酸荧光探针CM.四氢吖啶盐具有很强的吸电子能力，因此氯原子很容易被巯基取代。由于胺基和巯基之间的空间距离很近，当Cys和Hcy加入探针中时，在674 nm处有很强的荧光，尤其是Cys，荧光强度增加了20倍，而GSH对荧光几乎没有影响，因此，CM探针可以区分Cys/Hcy和GSH，可以应用于Cys/Hcy的检测。4-二巯基将阳离子菁IR-780和7-硝基-1，2，3-苯并恶二唑（NBD）连接在一起。它可以区分急性肝损伤中的Cys/Hcy和GSH。将GSH加入探针导致在805 nm处的荧光，而加入Cys/Hcy后，荧光发射峰位于545 nm处，两种探针对Cys/Hcy和GSH的荧光发射特性不同，结果表明，该探针可用于区分半胱氨酸/同型半胱氨酸和谷胱甘肽，也有探针可同时检测这三种生物硫醇，Zhang等报道了一种用于检测生物硫醇的比率比色探针。生物硫醇和色烯部分的α，β-不饱和酮之间可能发生点击反应，然后是吡喃的开环，然后形成苯酚，最后是羟基苄基部分的1，6-消除，形成荧光团2。
线粒体自噬通过溶酶体融合
衰老和受损的亚细胞器和蛋白质聚集体可以被回收或消除，这一过程称为自噬。它有助于维持线粒体的数量和质量。受损的线粒体首先进入自噬体，然后自噬体与溶酶体融合。对于探针PSeZ-QN，硒（Se）原子可以被HClO氧化，这抑制了光诱导电子转移（PET）效应，导致在648 nm处的荧光。在高粘度环境中，由于有限的TICT效应，氧化的PSeZ-QN的荧光信号可以进一步放大到531倍。有趣的是，当GSH加入到PSeZ-QN-Ox溶液中时，它可以被还原并恢复到其初始的PSeZ-QN状态，结果表明，HClO和GSH的存在使荧光发射光谱降低，这是一个氧化还原可逆过程。PSeZ-QN可能有助于阐明线粒体自噬过程。Feng等设计了线粒体膜电位非依赖性粘度探针来跟踪线粒体自噬过程。对于探针Mito-3，除了以喹啉单元作为线粒体靶向基团外，还在探针中引入了十二烷基链，其可以嵌入线粒体膜中，以提高探针与线粒体的结合亲和力。在低粘度下，由于TICT效应，探针显示微弱的荧光，随着粘度的增加，由于TICT效应的抑制，665 nm处的荧光增强了304倍。Mito-3用于监测饥饿诱导的线粒体自噬，他们发现线粒体自噬过程中粘度增加。Qing等还设计了一种可逆探针，M-HP，用于监测线粒体自噬期间H2O2相关的氧化还原失衡。由于PET效应，M-HP显示出弱荧光。H2O2可以与M-HP反应生成荧光硒酸类似物，其破坏PET过程，导致在465 nm处的荧光。通过M-HP的帮助，脂多糖处理后，线粒体H2O2浓度升高，雷帕霉素处理后，H2O2浓度降低，表明线粒体自噬增强后，氧化应激受到抑制。
其他靶向探针
线粒体靶向亚硫酸氢盐/亚硫酸盐
探针HSO3 −/SO32−是SO2的衍生物，是线粒体或细胞质中含硫氨基酸分解或硫化氢氧化产生的内源性产物，具有增强抗氧化能力、维持心血管结构和功能的作用，如降低血压、舒张血管等。亚硫酸氢盐/亚硫酸盐的异常水平可引发许多疾病，如心血管疾病、神经系统疾病和癌症。因此，监测SO2衍生物水平是有益的。Lin等报道了一种基于FRET效应的比率荧光探针PPA，其中二甲氨基苯乙烯基吡啶作为受体荧光团，吩噻嗪氧化物作为供体部分对于探针PPA，FRET效应是开启的，HSO3 −/SO32−与双键的亲核加成反应导致604 nm发射光谱的衰减，Fang等报道了一种基于ICT效应的吲哚苯并[e]吲哚探针InB。对于探针InB，由于吲哚到苯并[e]的强烈ICT，荧光光谱位于556 nm处。吲哚。HSO3-可以通过亲核加成攻击桥中的双键，抑制ICT效应，并产生474 nm的荧光。Xiao等报道了两种探针，其中吲哚阳离子分别与二乙氨基苯基和久洛尼定通过双键连接。HSO3 −/SO32−可以通过亲核加成反应与桥反应，中断分子内电荷转移（ICT），并导致荧光信号的变化。有趣的是，加入H2O2可使产物转变为原始探针状态。Qiu等人报道了一种基于苯并吡喃衍生物的探针DHPC。对于DHPC，ICT效应开启，在645 nm处有荧光。由于HSO3 −导致亲核加成，ICT效应受到抑制，荧光减弱。Wang等人报道了一种双功能荧光探针BID-OH，用于监测粘度和SO2。随着粘度从3 cP增加到460 cP，630 nm处的荧光强度增强了200倍。HSO3-可导致荧光光谱从630 nm蓝移。
线粒体靶向硫化氢（H2S）探针
H2S作为一种重要的信号气体递质，来源于L-半胱氨酸在胱硫醚β-合酶、胱硫醚γ-裂合酶和3-巯基丙酮酸硫转移酶的作用下的分解，H2S在不同组织和器官中的浓度存在一定程度的差异，如：在哺乳动物血清中约为30-100 μM，在中枢神经系统中约为50-160 μM 。线粒体中的H2S可在氧化应激中发挥作用，导致细胞功能障碍和死亡。H2S水平与许多生理过程有关，包括血管舒张、血管生成、神经调节、细胞凋亡、和炎症。异常的H2S水平可引发AD、肝硬化等疾病。因此，研究人员设计了多种探针来跟踪细胞或人体内H2S的浓度。Chen等人设计了一种多功能探针SW 2，用于同时识别H2S和SO2水平该探针在814 nm处有较强的荧光，当H2S加入到探针中时，巯基会攻击苯并吡喃鎓，而探针SW 2 ，SDI ，探针1 ，HBTP-H2S 、DPTZ 、HCy-SSPy 、Rho-H2S ，以及它们对H2S的响应。所得加成产物显示出很弱的荧光，加入H2O2不能消除巯基，相比之下，加入SO 32-也能引起加成反应，在460 nm处产生很强的荧光，此时，H2O2可以除去-SO_3-基团，使加成产物恢复到初始状态，因此，SW_2有助于理解H_2S与SO_2之间复杂的关系. Gu等设计了一种硫化氢探针SDI，基于加成反应（图28 b）。SDI在680 nm处显示荧光，H2S可与探针反应并破坏偶联结构，导致荧光减弱。该探针的检测限较低（56 nM），响应时间较快（60 s）。James等报道了一种检测H2S和肼的双发射探针。探针显示出微弱的荧光，H2S可以去除噻吩甲酰基并诱导产生羟基产物，具有较强的ICT效应。此外，羟基和苯并噻唑可以触发ESIPT效应。在475 nm和415 nm的激发光下，产物分别在590 nm和485 nm处产生荧光，而N2 H4除了与酯基反应外，还与双键反应，在510 nm处产生荧光，探针1的检测限很低，Liu等还报道了一种基于ESIPT的探针HBTP-H2S，通过修饰2-氨基-3-甲基-3-苯基-3-甲基-3-氨基-3-苯基-3-甲基-3-苯基-2′-羟基苯并噻唑支架。H2S与探针之间的亲核加成反应导致共轭结构的断裂。因此，发射从650纳米移动到470纳米。
线粒体靶向金属阳离子探针
细胞内存在多种金属阳离子，如Cu2+、Fe3+、Ca2+等，它们在维持线粒体功能，如能量代谢、氧化还原平衡、信号转导等方面起着关键作用，金属阳离子水平异常可能导致线粒体功能障碍和细胞损伤，此外，一些重金属离子可能通过食物、水或与有毒污染物接触进入人体，因此，设计特异性的靶向探针来监测金属离子的波动对人类健康具有重要意义。铜与酪氨酸酶、细胞色素氧化酶等酶的合成有关，还参与血红蛋白和铁的过程，此外，它在神经系统中发挥作用，Cu2+的异常水平与神经母细胞瘤、AD、Wilson病等疾病有关。Xiao等设计了一种六元螺罗丹明探针SRh-OH，监测线粒体和溶酶体中的Cu2+。SRh-OH不显示荧光。当溶液中加入Cu2+时，它可以引发与探针的络合反应，六元螺环断裂，形成共轭结构。因此，该配合物在593 nm处的荧光强度增强了17倍，除配合反应外，一些Cu2+探针可消除识别基团，如New等报道的比率荧光探针CyCu 1，基于Cu 2+催化的水解反应检测脑中的内源性Cu2+。探针在810 nm处显示发射光谱，加入Cu2+导致发射蓝移至600 nm。除了作为目标分析物外，Cu2+还可以与探针形成中间体，进一步监测其他分析物，例如，Xu等报道了一种香豆素席夫碱探针（NCMP），用于监测线粒体中的Cu ~（2+）和谷胱甘肽（GSH. NCMP在525 nm处显示出强发射，并且加入的Cu 2+与探针反应形成配位化合物，结果表明，该探针对Cu2+和GSH的检测限分别为19.8nM和82.0nM，对Cu2+和GSH的检测限分别为19.8nM和82.0nM。作为实质性的硫醇，包括两种形式：Yoo等人设计了一种双通道探针CIA，用于检测Cu2+和GSSG，并将其应用于靶向肿瘤的生物成像。有趣的是，CIA显示与上述NCMP相反的“关-开-关”荧光信号。由于有限的ICT效应，探针CIA显示非常弱的荧光，结果表明，Cu ~（2+）可与探针形成络合物，激活ICT效应，导致荧光增强，进一步加入GSSG可使中间体恢复到初始状态，导致荧光显著减弱，除直接检测Cu2+或与Cu2+形成中间体的探针外，一些探针与其它探针具有协同效应，例如，Shen等人设计了一种“开启”探针，MitoRhB，其可与Cu2+反应，靶向线粒体，用于检测线粒体膜电位（MMP）的变化。探针显示微弱的荧光，随着Cu2+浓度的增加，由于形成复合物，荧光强度增加，生成的复合物可进入线粒体，Cu2+浓度的增加可加速线粒体去极化，降低MMP。通过MitoRhB和HaloP 1双探针系统，MMP去极化可增强蛋白聚集，导致铜诱导的细胞死亡，因此，Cu 2+探针可通过三种方式发挥其优势：通过专门监测Cu 2+浓度，通过形成用于进一步检测其它分析物的中间体，丰富的检测途径充分发挥了探针的优势，拓宽了探针在疾病诊断中的应用。除了Cu2+探针外，还探索了其他金属阳离子探针用于检测疾病。
结论与展望
由于荧光探针的巨大优势和线粒体在能量产生中的关键作用，本文综述了近年来以线粒体为靶点的荧光探针的研究进展，首先介绍了PET、ICT、FRET、AIE等荧光探针的工作机理，然后总结了以线粒体为靶点的荧光探针的设计策略，并介绍了四种以线粒体为靶点的阳离子，本文介绍了近年来在生物检测领域的研究进展，包括TPP+、吡啶鎓、罗丹明衍生物、吲哚鎓衍生物等，最后重点介绍了近年来在活性氧、酶、粘度等方面的研究进展。这些探针具有响应时间快、生物相容性好、荧光响应变化显著等优点，在临床应用方面取得了很大的成就，但仍存在一些问题，我们预测，靶向探针的发展方向可能是以下几个方面。(1)染料结构的优化设计策略。(2)多响应探针的设计和干扰的消除。(3)线粒体靶向诊疗一体化。(4)NIR-II区域探针的设计和合成.虽然已经开发了各种各样的探针，但大多数在可见光谱中起作用，而适用于近红外窗口的探针仍然相对有限。(5)将探针从实验室环境转化为临床应用
参考文献
Recent advances in the mitochondria-targeting small molecule fluorescent probes: from the principal design to biological applications， Di Zhang，Qiong Wu , Yanan Ding， Lin Li, Zhipeng Zhang, Changmin Yu*, Coord. Chem. Rev. 548（2026）217229，https://doi.org/10.1016/j.ccr.2025.217229
