内容提要
传统的小分子荧光探针通常基于单一位点的反应，对低活性物质响应不佳，同时生物体内的共存物往往会干扰，产生假阳性信号，造成灵敏度与选择性不足。多识别位点的小分子荧光探针具有的多个识别位点好比多把特异性的锁，只有待测物携带的多把钥匙一一解锁才能完成响应，实现高选择性的分析；同时多个位点的存在增大了探针捕捉待测物的几率，进而提高了反应的灵敏度，能够实现对低活性物质的检测，很好的弥补了传统单一位点探针的缺憾。本综述归纳了目前设计多识别位点小分子荧光探针的一般范式，并总结了近期多位点荧光探针在儿茶酚胺类、硫醇类、ATP等生物小分子的应用。
机理1: 具有多识别位点分子探针的识别方式
图1: 单一识别位点分子探针的识别方式
多识别位点分子荧光探针的设计范式：
方法1:直接引入多个识别位点。这类探针在与被分析物相遇时，探针上的多个识别位点会与被分析物的多个响应基团特异性结合，在一一完成响应后产生荧光信号的变化，实现对待测物的特异性识别。该设计目前主要在生物硫醇（GSH、Cys、Hcy）的识别上应用为多，利用硫醇分子特有的巯基与氨基与不同硫醇分子不一的碳链长度，可在探针上引入可与之响应的识别基团，可实现对多种硫醇分子的同时检测。
方法2:利用被分析物与探针间形成的多种非共价作用力的合力，如：π-π作用、静电相互作用、分子间氢键和主客体相互作用等。部分生物分子自带正电荷和大的共轭体系，利用这些结构在探针上引入负电荷和共轭体系可与之形成多种分子间的非共价作用力，其合力能够实现探针分子共轭结构的变化导致荧光信号的变化来实现响应。ATP分子凭借其特有的多磷酸基团、碱基的共轭结构和邻苯二酚的羟基，成为这类方法的主要检测对象。
方法3:连续出现的识别位点。与前两种方法不同，此类探针一开始只具有一个识别位点，但在该识别位点完成响应后，会迅速生成第二个甚至第三个识别位点，依次与待测物的基团特异性响应，在实现级联反应最终产生对应的荧光信号。该方法在去儿茶酚胺类的检测上使用较多，利用儿茶酚胺特有的邻苯二酚和胺基结构，依次设置识别位点，通过级联反应完成响应。
图2： 基于方法1(图a)、2(图b)、3(图c)所设计探针的响应机理
以上三种方法是开发多识别位点分子荧光探针的常用方法。这类多识别位点荧光探针的出现大大减少了假阳性信号的可能，从而使检测结果更加准确，有助于实现高选择性和高灵敏度的分析，同时充分体现了反应型分子荧光探针相对于其他检测方法的优势。由此可见，在荧光探针上引入多识别位点是解决当前荧光成像检测性能所面临困难与挑战的最佳途径之一。
参考文献
Recent progress of molecular fluorescent probes with multi-recognition sites enable sensitive and selective analysis.Haifeng Ge, Qiaozhen Ye, Tenglong Zou, Dailiang Zhang *, Hongwen Liu *, Ronghua Yang. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2024, 174,117685, http://dx.doi.org/https://doi.org/10.1016/j.trac.2024.117685.
