内容提要
对于5年生存率低且缺乏有效治疗方法的胰腺导管腺癌(PDAC)，死亡铁调节是一种强有力的治疗选择。然而，由于铁死亡在促进和抑制胰腺肿瘤发生中的双重作用，调节铁死亡程度对于获得PDAC的最佳治疗效果非常重要。由于谷胱甘肽(GSH)的合成途径受到抑制，生物硫醇被活性氧耗尽，导致生物硫醇水平急剧下降，因此生物硫醇适合作为成像铁死亡的生物标志物。此外，最近的一项研究报道，半胱氨酸(Cys)缺失可导致小鼠胰腺肿瘤铁死亡，可能被用作PDAC的有效治疗策略。因此，可视化生物硫醇在PDAC铁死亡中的作用，有助于调控铁死亡程度，了解Cys耗竭诱导胰腺肿瘤铁死亡的机制，进一步促进PDAC的研究和治疗。本文报道了两种生物硫醇激活的近红外(NIR)荧光/光声双模态成像探针(HYD-BX和HYD-DX)用于胰腺肿瘤铁死亡的成像。这两种探针对溶液、细胞和肿瘤中的生物硫醇具有优异的双模态响应性能。随后，它们被成功地用于实时可视化PDAC细胞和HepG2细胞中铁死亡过程中生物硫醇浓度水平的变化。最重要的是，它们已进一步应用于小鼠胰腺癌铁死亡的双模态成像，并取得了令人满意的结果。这两种探针的开发为监测铁死亡中生物硫醇浓度水平的变化提供了新的工具，对了解Cys消耗诱导的胰腺肿瘤铁死亡的机制以及进一步促进PDAC的研究和治疗具有积极的影响。
结果与讨论
探针的设计与合成
Cys和GSH与胰腺癌铁死亡具有内在联系。本文以Cys和GSH等生物硫醇为生物标志物，激活胰腺癌铁死亡的近红外荧光/PA双模态成像。为了实现Cys和GSH的平行检测，研制了HYD-BX和HYD-DX两种探针。探针由具有近红外荧光和增强PA信号的染料(s - hd)42作为发色团，丙烯酸酯官能团和2,4-二硝基苯磺酰基分别作为Cys和总生物硫醇的识别位点组成。在探针形式中，由于酚羟基受到两种识别基团的保护，基于ICT和PET两种机制的融合抑制了发色团的近红外荧光信号，同时伴有短波长的最大吸收。两个探针被生物硫醇激活后，释放出具有近红外荧光/PA双模态信号的染料(s - hd)，从而实现生物硫醇的双模态响应。此外，在探针HR- bx侧链上引入羧基，得到亲水性更好的探针HYD-BX，并在丙烯酸酯官能团对染料(HR)荧光产生ICT抑制的基础上，进一步引入PET抑制探针HR- bx的本征荧光，从而获得更高的检测Cys的信本比(SBR)。通过与具有疏水侧链的对照探针(HR-BX)的比较证明了这一点，并通过密度泛函理论(DFT)计算进一步证实了这一点。
生物硫醇探针的光谱分析研究
首先，研究了HYD-BX对Cys的近红外荧光/PA双模态响应(图1A - 1E和S7A - D)。随着Cys浓度的增加(0 ~ 100 μM)，在765 nm处发现样品的荧光增强了近8倍，说明HYD-BX对Cys有很好的响应。其工作曲线如图所示，计算出的检测限LOD为1.6 μM。相比之下，对照探针HR-BX仅显示出约4倍的增强，这表明将羧基引入骨架的作用。为了探讨HYD-BX在体内半定量分析的适用性，还通过体内成像系统检验了其线性关系。在10 ~ 80 μM的Cys浓度范围内，荧光强度与Cys浓度呈良好的线性关系(I 2 = 0.992)。根据标定曲线计算出LOD为2.8 μM。HYD-BX体内成像系统对Cys的线性响应范围可以覆盖正常细胞和癌细胞中Cys浓度的波动范围，有利于半定量检测肿瘤内的Cys。同时，HYD-BX对Cys的敏感LOD也适用于监测Cys消耗诱导胰腺肿瘤铁死亡过程中Cys浓度的变化。随后，测量了HYD-BX与Cys反应的实时动力学(图S7A)。令人鼓舞的是，HYD-BX显示了在10分钟内激活强大的近红外荧光的能力，这表明它具有快速检测Cys的潜力。此外，我们还研究了HYD-BX响应Cys前后的紫外-可见(UV - vis)吸收光谱，我们发现625 nm处的吸收峰逐渐降低，735 nm处的吸收峰逐渐升高。esi -质谱结果证实了HYD- bx和HYD分子转化引起的吸收光谱变化。受HYD-BX与Cys响应过程中紫外-可见吸收光谱特性的启发，我们检测了HYD-BX对Cys的PA特性，如图1D所示。与紫外吸收光谱相似，加入Cys前后，被试样品中735 nm处的PA信号增强最为显著。同时进行PA滴定实验，可以明显看出，随着Cys加入量的增加，735 nm处的PA强度逐渐增强，且在Cys浓度为0 ~ 80 μM范围内呈良好的线性关系，计算出的PA检出限为3.7 μM，由于PA成像灵敏度较低，低于荧光检测结果26我们还研究了pH(4−9)对HYD- bx荧光检测Cys的影响，结果表明HYD- bx和HYD在生理条件下表现良好。为了避免常见干扰物质引起的假阳性信号，对Cys进行了选择性实验。在存在Cys或干扰物质的情况下，HYD-BX对Cys表现出明显的荧光/PA双模态信号增强，说明HYD-BX对Cys具有极好的选择性。随后，按照类似的程序，我们研究了HYD-DX对生物硫醇的反应。与先前报道的以2,4 -二硝基苯磺酰基作为生物硫醇识别位点的探针类似，HYD-DX对GSH、Cys、Hcy和H2S等几种生物硫醇具有良好的近红外荧光/PA双模态响应，适用的检测范围为pH(6−9)，响应时间分别约为20、25、30和35 min。加入这四种生物硫醇前后，荧光光谱、HYD-DX样品的紫外-可见吸收光谱和PA光谱与探针HYD-BX的变化趋势相似。4种生物硫醇(GSH、Cys、Hcy、H2S)的荧光成像线性范围分别为0 ~ 80、10 ~ 80、10 ~ 80和10 ~ 80 μM, lod分别为3.8、5.6、4.6和4.3 μM;HYD-DX对PA的线性检测范围分别为0 ~ 100 μM、0 ~ 100 μM、0 ~ 80 μM和0 ~ 100 μM, lod分别为7.3、6.8、8.1和7.6 μM。
这些结果表明，HYD-DX对监测肿瘤内GSH浓度变化足够敏感，而对其他生物硫醇不敏感。值得指出的是，在生理浓度下，由于GSH浓度最高，HYD-DX对GSH的响应率和荧光增强明显优于其他三种生物硫醇(Cys、Hcy和H2S)。因此，我们可以大致假设，在细胞和体内成像时，HYD-DX的信号增强主要是由GSH引起的，信号增强的程度取决于细胞和体内GSH的浓度水平。随后，我们分别在小鼠血浆和DMEM中进行了应答试验，发现HYDDX对血清有应答，但对DMEM不显著;HYD-BX对小鼠血浆有轻微应答，但对DMEM不显著，说明HYD-BX对Cys具有良好的选择性和稳定性。
肿瘤细胞和肿瘤小鼠生物硫醇的双模态成像
基于两种探针在体外对生物硫醇的良好响应性能，我们进一步研究了两种探针的生物相容性，结果显示HYD-BX和HYD-DX具有较低的细胞毒性。随后，以panc02细胞(小鼠PDAC细胞)和HepG2细胞(人肝癌细胞)为研究对象，研究HYD-BX和HYD-DX对Cys (HYD-BX)和GSH (HYD-DX)的荧光成像性能。仅用HYD-BX或HYD-DX处理的panc02细胞组表现出较强的荧光。用NEM预培养细胞，再用HYD-BX或HYD-DX孵育细胞，观察到微弱的荧光信号，这是由于NEM消除了内源性的Cys或GSH。对于HYD-BX, NEM处理后仅添加Cys, HepG2细胞也出现了强荧光。对于HYD-DX, NEM处理后进一步添加四种生物硫醇(Cys、GSH、Hcy、H2S)均产生强荧光。这些结果表明，HYD-BX可以选择性地成像细胞内的Cys, HYD-DX可以选择性地成像细胞内的GSH。为了验证HYDBX和HYD-DX成像能力的普遍性，我们也将这两种探针应用于HepG2细胞，也观察到类似的现象。此外，正在研究癌细胞(HepG2和panc02)中内源性Cys与HYD-BX或GSH与HYD-DX的实时成像。对于HYD-BX和HYD-DX，观察到的荧光强度均逐渐增加，并在30 min时达到各自的最大值。
在细胞研究中证实了HYD-BX和HYDDX优异的成像能力后，随后的研究重点是它们在体内的双模态成像性能。首先，利用HYD-BX或HYD-DX对荷瘤小鼠体内内源性Cys和GSH进行近红外荧光成像。同时将HYD-BX注射到肿瘤和正常组织后，随着时间的推移，肿瘤内的荧光强度明显增加(正常或肿瘤/空白:SBR约为6)，而正常组织中的荧光强度保持在较低水平(SBR约为1)。将肿瘤用4 mM NEM预培养30 min后，注射HYD-BX，肿瘤内荧光强度明显降低，保持在较低水平，与正常组织相似。对于HYD-DX，观察到类似的荧光强度变化趋势。上述结果表明，HYD-BX和HYD-DX能够通过近红外荧光成像肿瘤中Cys或GSH水平的变化。随后，我们进一步研究了HYD-BX或HYD-DX对pan02 -荷瘤小鼠内源性Cys和GSH的PA成像。HYD-BX同时注射到肿瘤和正常组织中，随着时间的推移，肿瘤内的PA强度显著增加，而正常组织中的荧光强度相对较低。4 mM NEM预培养肿瘤30 min后注射HYD-BX，肿瘤内PA强度明显降低，维持在较低水平，与正常组织相似。对于HYD-DX，观察到类似的PA强度趋势。这些结果表明，HYD-BX和HYD-DX能够通过PA信号改变肿瘤中Cys或GSH含量的影像学变化。
癌细胞中铁死亡的荧光成像及肿瘤小鼠中铁死亡的双模态成像
受HYD-BX和HYD-DX在生物硫醇上出色的双模态成像性能的鼓舞，我们采用与铁死亡相关的Cys和GSH作为生物标志物，利用这两种探针对癌细胞中的铁死亡进行双模态成像。首先，我们利用这两种探针在不含半胱氨酸的培养基中研究了erastin(一种铁死亡诱导剂)的添加量与癌细胞铁死亡程度的关系。，对于HYD-BX或HYD-DX，细胞发出的荧光强度随着诱导剂添加量的增加而降低，说明这两种探针可以用于铁死亡程度的监测。仅用HYD-BX和HYD-DX处理的细胞显示出较强的荧光。当细胞暴露于erastin并随后与HYD-BX或HYD-DX孵育时，细胞表现出微弱的荧光，这是因为细胞内的生物硫醇在铁凋亡过程中被大量的ROS大量消耗。同时，用铁死亡抑制剂fe -1预培养细胞时，细胞仍能发出较强的荧光，说明fe -1不影响细胞内生物硫醇浓度。当细胞与erastin和Fer-1预培养时，与只添加erastin的细胞相比，细胞发出的荧光增强，这是由于抑制了ferroptosis，减少了ROS的产生。作为对照，我们也在含胱氨酸的培养基中进行了上述实验;结果与无胱氨酸培养基中的结果相似，这与pdac在铁沉过程中胱氨酸的输入被显著抑制的事实是一致的。6同时，我们也在HepG2细胞中进行了同样的处理，观察到类似的实验现象。我们进一步进行实验研究顺铂是否会诱导panc02细胞铁死亡。细胞成像结果显示，在加入探针前，10 μM顺铂处理24h的panc02细胞信号明显降低。然而，当用铁死亡抑制剂预处理细胞时，这种现象发生了改变，表明顺铂可以诱导panc02细胞铁死亡。流式细胞术证实了这些结果。
为了进一步证明这两种探针在体内观察铁死亡的能力，我们研究了它们在近红外荧光/光声双模态成像中对胰腺癌小鼠铁死亡的表现。将HYD-BX注入肿瘤后，肿瘤内的荧光强度随着时间的推移明显增加。肿瘤经erastin预处理24h后再注射HYD-BX，肿瘤内荧光强度明显降低，维持在较低水平。用erastin预处理肿瘤4小时，用fe -1预处理肿瘤4小时，再注射HYD-BX，肿瘤内的荧光强度比只用erastin预处理的肿瘤增强。HYD-BX的PA成像实验结果也呈现出与荧光成像实验相同的趋势。SBR对比分析表明，该探针可有效监测肿瘤活体小鼠的铁死亡。对于HYD-DX，也观察到类似的趋势。最后，我们使用探针研究了顺铂诱导的panc02肿瘤铁死亡。肿瘤影像学结果显示，4 mM顺铂治疗24h后的panc02肿瘤信号明显减弱。然而，当用铁死亡抑制剂预处理肿瘤时，这种现象被抑制，这表明顺铂可以诱导panc02肿瘤的铁死亡。上述结果表明，HYD-BX和HYD-DX能够对胰腺癌铁死亡进行近红外荧光/PA双模态成像，为监测铁死亡生物硫醇浓度水平变化提供了新的工具。
总结
总之，我们报道了两种近红外荧光/PA双模态成像探针，它们对溶液、细胞和肿瘤中的生物硫醇表现出优异的双模态响应性能。此外，它们还被用于实时监测癌细胞铁死亡过程中生物硫醇浓度水平的变化。值得注意的是，这些探针也已成功地用于小鼠胰腺癌铁死亡的双模态成像。这两种探针的开发为监测铁死亡中生物硫醇浓度水平的变化提供了新的工具，对了解Cys消耗诱导的胰腺肿瘤铁死亡的机制以及进一步促进PDAC的研究和治疗具有积极的影响。
参考文献
NIR Fluorescent/Photoacoustic Bimodal Imaging of Ferroptosis in Pancreatic Cancer Using Biothiols-Activable Probes， Lingyun Li, Zhipengjun Zhang, Lei Zhou,* Haifeng Ge, Yixing Zhao, Yijun Gong, Guo-Jiang Mao,* and Hongwen Liu*，Anal. Chem. 2024, 96, 7248−7256，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c00922
