内容提要
循环缺氧已被公认为广泛的肝脏疾病的典型特征，其实时成像对于更好地了解其生物学功能是必要的。然而，目前还缺乏有效的光学探针来检测肝脏的可逆性缺氧。在此，我们设计了一种近红外荧光/光声(NIRF/ PA)探针AzoCys-CF3，该探针在正常缺氧循环中显示出高度选择性和可逆的NIRF和PA信号的开关。AzoCys-CF3不仅监测肝缺血再灌注过程中的急性缺氧状态，还可追踪非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型小鼠的慢性肝缺氧程度。AzoCysCF3抗氧化药物筛选表明，肝保护药物奥利司他可显著减轻NAFLD小鼠肝脏缺氧。本研究为体内循环缺氧监测提供了一种可靠的NIRF/ PA显像剂，在肝脏疾病药物筛选中具有潜在的应用前景。
结果与讨论
可逆低氧响应探针AzoCys-CF3的设计与构建
与杂蒽半菁相比，硫杂蒽半菁具有红移的近红外发射和更高的摩尔消光系数因此，为了提高NIRF/PA的双成像性能，我们选择了硫代蒽-半菁染料作为报道片段。重要的是，据报道，半花青素染料主要在肝脏中积累，从而保证了肝损伤成像的可行性。随后，3,5-二三氟甲基苯芳基被引入作为荧光猝灭剂和缺氧反应基团，从先前的文献中得知，在缺氧-再氧循环中实现可逆行为。
AzoCys-CF3对体外缺氧的感知行为
首先通过观察含RLM (250 μg/mL)和NADPH (100 μM，偶氮还原酶的辅助因子)的钾PBS (pH = 7.4, 10 mM, 37°C)中AzoCys-CF3的紫外可见吸收和荧光变化来评价其体外缺氧感知能力。AzoCys-CF3最初在625 nm处显示出最大吸收峰，随着RLM的加入，在720 - 800 nm范围内产生了显著的色移。在常压条件下，由于偶氮基团的有效猝灭，探针显示出最小的荧光。然而，在低氧环境下，在760 nm处观察到一个显著的开启荧光信号，增强了96.3倍，远远高于我们组先前报道的探针(约6倍)以吲哚菁绿(ICG)(在DMSO中Φ = 0.13)为对照，AzoCys-CF3后氧反应的荧光量子产率为0.08。值得注意的是，荧光强度随着暴露于空气中而周期性地打开和关闭，在至少五个缺氧-再氧化循环中保持一致的强度。在RLM和NADPH缺氧条件下，AzoCys-CF3的高分辨率质谱显示，在m/z 654.22895处出现了一个新的质谱峰，该质谱峰被确定为未进一步还原分解的双电子还原中间体苯肼衍生物(Cys-CF3-HZ)。与时间相关的测量表明，荧光强度在缺氧环境中孵育25分钟后达到稳定。此外，随着探针与RLM反应时间的延长，AzoCys-CF3在720 nm处的PA信号也显著增强(NADPH)。测试了各种生物相关的干扰物质常见离子(Na+、K+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Mg2+、Fe3+和Al3+)、氧化剂(ClO−和H2O2)和还原剂[谷胱甘肽(GSH)、Hcy、Cys、ASC和草酸]，对荧光强度没有显著影响，表明AzoCys-CF3对缺氧有很高的选择性。此外，AzoCys-CF3对缺氧的荧光强度在生理pH水平(4 ~ 9)下保持稳定，这有利于其在复杂系统中的应用。这些结果表明，探针AzoCys-CF3以可逆的方式选择性地响应缺氧。
AzoCys-CF3对肝细胞循环缺氧成像的影响
由于AzoCys-CF3在体外表现优异，我们对肝脏L02正常细胞和HepG2癌细胞进行了研究，以评估它们对细胞缺氧的成像能力。首先使用标准MTT法检测AzoCys-CF3的细胞毒性，结果显示，在浓度高达12.8 μM的情况下，孵育24小时后，探针的细胞毒性可以忽略不计。随后，用4 μM AzoCys-CF3培养细胞，并在不同的氧条件下培养:正氧(20%O2)、微氧(6-12% O2)和低氧(0.1% O2)作用4小时。正如预期的那样，细胞在正氧条件下的荧光可以忽略，而随着氧浓度降至6-12%和0.1% O2，荧光强度逐渐增强，当氧浓度降至0.1%时，荧光强度显著增强约7倍。此外，我们通过在缺氧条件下分别用探针和MitoTracker Green、LysoTracker Green和Hoechst 33342染色HepG2细胞来测试AzoCys-CF3的亚细胞共定位。
AzoCys-CF3的荧光与MitoTracker Green的荧光密切重叠，Pearson相关系数为0.94，表明其在探索缺氧相关的线粒体功能障碍方面具有潜力。此外，当孵育气氛从缺氧切换到常氧条件时，探针的细胞内缺氧响应荧光显著减弱。在随后的脱氧和复氧循环中，AzoCys-CF3染色的肝细胞观察到可逆的开关荧光开关，表明AzoCys-CF3有效地显示了肝细胞内相对缺氧水平的动态变化。
荷瘤小鼠模型双模缺氧显像
低氧是肿瘤微环境的标志，是肿瘤快速生长和过度耗氧的结果，为进一步研究AzoCys-CF3在体内双模生物成像中的适用性提供了可靠的低氧模型。将45-47个HepG2细胞皮下植入BALB/c小鼠的侧翼，让肿瘤生长至200 mm3的体积。随后，将AzoCys-CF3注射到肿瘤和皮下两侧，在790±20 nm处采集两侧图像。肿瘤区域的荧光强度相对于皮下注射部位呈现出3.7倍的时间依赖性增强;然而，随着时间的推移，皮下侧翼的强度几乎保持不变。
与NIRF成像结果相似，肿瘤部位的PA720 nm信号在1.0 h内明显增强，而皮下侧翼的PA720 nm信号没有明显增强。其中，肿瘤区域的PA强度是皮下侧腹的4.0倍。PA成像以其高分辨率和深成像深度而闻名，有助于精确评估不同肿瘤区域的肿瘤内缺氧。可见，肿瘤表面的PA720 nm强度弱得多，而肿瘤深层组织的PA720 nm强度明显增加(2.7倍)，表明实体瘤内氧分布高度不均匀。相比之下，由于缺乏缺氧特征，健康皮下侧腹的PA720 nm值在不同组织深度上变化不大。这些发现强调了AzoCys-CF3作为体内肿瘤缺氧水平定量可视化的有力分子工具的有效性，表明AzoCys-CF3作为一种新的反应性和诊断性探针的潜力，可以在肿瘤检测之外的更广泛的临床应用。
在NIRF成像取得初步成功后，PA成像也被用于监测HIR过程，通过尾静脉注射AzoCys-CF3。重复常氧-缺氧循环后，在720 nm处观察到类似的PA强度变化。肝缺血时PA强度增强，再灌注后减弱。相比之下，假手术组的PA信号没有明显变化，这加强了探针对缺血情况反应的特异性。H&E染色检查进一步揭示了hir处理小鼠肝脏切片的广泛损伤，表现为明显的细胞溶解、肝细胞坏死和出血。观察到缺氧诱导因子1α (HIF-1α)上调。HIF-1α是一个关键的转录调节因子，协调各种细胞和组织对缺氧的细胞反应，在HIR期间肝脏内发出急性缺氧应激信号。这些结果证实，通过双模NIRF/PA成像，AzoCys-CF3可以将HIR过程可视化至少三个周期。
影像引导下NAFLD药物疗效评价
NAFLD是全球最普遍的慢性肝病，范围从单纯脂肪变性到肝硬化。54,55慢性缺氧与NAFLD的发病机制有关，特别是在HFD小鼠中。然而，目前很少有研究通过监测体内缺氧程度来评估肝保护药物的疗效。因此，我们进一步在NAFLD小鼠模型中采用NIRF/PA双模成像监测肝缺氧并评估各种肝保护药物的有效性。我们根据不同的结构类型筛选了6种肝保护剂， 56-59分别是奥比胆酸(OCA)、奥利司他(OLST)、己酮茶碱(PTX)、n -乙酰半胱氨酸(NAC)、α-硫辛酸(α-LA)和s -腺苷蛋氨酸(SAM)。按照标准方案，用HFD喂养小鼠8周，建立NAFLD模型。接下来，将小鼠分为8组，包括正常对照组(NC)组、HFD组和康复组(分别用6种药物饮食治疗)。然后通过尾静脉给药AzoCys-CF3，对于HFD小鼠组，HFD组的肝脏荧光约为NC组的2.6倍，而康复组的荧光信号较HFD组弱。有趣的是，SAM和OLST组肝脏荧光下降更明显，分别比HFD组低42%和54%。不同组小鼠主要解剖器官的荧光图像与体内荧光成像一致。与NIRF结果一致，体内720 nm的PA成像进一步验证了这些发现，显示SAM组和OLST组的PA强度显著降低。其优越的治疗效果归因于SAM是一种典型的抗氧化剂，可增加肝内GSH水平，OLST是一种可逆的胰腺和胃脂肪酶抑制剂，具有抗肥胖和抗氧化特性。60,61肝组织中HIF1α的测定为NAFLD治疗提供了直接证据。HIF-1α在HFD组显著上调，而NC组和药物治疗组HIF-1α水平明显降低，尤其是SAM和OLST组，这与体内NIRF/PA信号的变化符合得很好。这些结果证实AzoCys-CF3是一种有效的NIRF/PA双显像剂，用于实时监测慢性肝缺氧和评估肝保护剂对NAFLD的治疗效果。这种方法不仅促进了药物疗效的评估，而且增强了我们对NAFLD进展的缺氧机制的理解。
肝损伤通常通过血清生化指标进行评估，包括ALT、AST和γ-GGT，并通过H&E染色进行组织病理学检查。与NC组相比，HFD组血清ALT、AST和γ-GGT水平明显升高，而康复组明显下调。同时，组织病理学分析显示，使用HFD的小鼠出现肝脏脂肪变性，其特征是肝脏内积聚了大量病理性脂滴(箭头所示)。相反，康复组的炎症程度明显减轻。因此，这些生化检查结果与使用缺氧水平作为生物标志物的体内NIRF/PA成像的表现密切相关。
总结
我们通过合成3,5-二三氟甲基苯和一个硫代蒽醌荧光团，开发了一种新的芳基偶氮偶联近红外荧光探针AzoCys-CF3。AzoCys-CF3在肝细胞中对缺氧表现出高选择性和高灵敏度的可逆的OFF-ON NIRF/PA反应，并进一步有效地可视化了肿瘤移植小鼠模型的缺氧状态。更重要的是，NIRF/PA成像能够监测小鼠HIR过程中的急性缺氧-常氧循环。此外，该探针可用于评估NAFLD小鼠肝脏慢性肝缺氧的程度，我们发现在6种药物中，奥利司他和SAM在减轻肝缺氧和NAFLD方面表现更好。我们的研究结果强调了AzoCys-CF3作为一种可靠而强大的双模式显像剂的价值，它在了解与循环缺氧相关的疾病的病理进展中起着关键作用。
参考文献
Dual-Mode Reversible Imaging of the Hypoxia Status of Acute and Chronic Hepatic Injury ，Shankun Yao , Zelong Wu , Yuming Zhang , Tao Yang , Hao Yuan , Weizhong Ding , Weijiang He , Zijian Guo * & Yuncong Chen *, CCS Chem. 2024，https://doi.org/10.31635/ccschem.024.202404092
