内容提要
肿瘤特异性可激活长波光敏剂(PSs)有望克服传统光动力疗法(PDT)的局限性，如全身光毒性和浅层组织穿透。然而，它们的LW光吸收不足，单线态氧量子率低(1O2)，通常需要高激光功率密度来产生热能，协同增强PDT。强烈的光热辐射引起急性疼痛，大大降低了患者的依从性，阻碍了LW PDT更广泛的临床应用。通过激子动力学分解策略，我们开发了一系列ph可活化的基于花青素的LW ps (LET-R, R = H, Cl, Br, I)，其中活化的LET-I在808 nm处表现出很强的光吸收，与吲哚菁绿相比，在1O2处具有3.2倍的显著增强。瞬态光谱分析和理论计算证实了其显著促进了系统间的交叉，同时增强了LW荧光发射特性。这些特点使得叶酸修饰的LET-I探针(LET-I-FA)在808 nm的超低激光功率密度(0.2 W cm-2)照射下，无需光热协同作用，就能在可激活的荧光和光声双峰成像的支持下完全光动力根除肿瘤。
结果与讨论
分子设计与合成
选择了一种菁氨酸骨架，因为它在大约800 nm处具有很强的LW吸收。在七甲基链中加入环己烯环以增加分子稳定性。此外，在吲哚片段的位置上加入了一个亲核羟基，作为一个可逆的PH响应元件。与典型的质子化机制不同，PH响应策略是基于特定共价键的切割。制备的LET-R为环封闭结构，在酸活化过程中，其醚键逐渐裂解生成环开放的对应物(称为LET-R’)。这种结构转变恢复了经典的菁氨酸结构，从而开启了分子内电荷转移(ICT)，随着PH值的降低激活了LW吸收和FL发射。为了利用激子动力学增强ROS的生成，利用卤化菁氨酸的易合成性，以及它们的重原子效应和卤素诱导的分子间/分子内弱相互作用，将Cl、Br和I等各种卤素原子分别引入吲哚环。此外，有研究发现，含有多个碘取代基的近红外染料往往表现出FL信号减弱和光热效应增强，这不利于光敏化和成像。因此，本研究设计了二取代菁氨酸衍生物。以改性吲哚和六原子环中间体为原料，缩合合成了二取代菁氨酸衍生物。随后，酯基在碱性反应条件下水解，形成ph响应的OH基团，生成醚键。
光物理和光化学性质
LET-R的激活伴随着显著的颜色变化以及LW吸收和FL发射的增强。以LET-I为例，它在溶剂中呈黄色，在430 nm处表现出微弱的光吸收，在500 nm处表现出荧光发射。经酸活化形成LET-I’后，其溶液颜色变为绿色，并在808 nm处观察到强吸收。随着pH值的变化，808 nm处的吸光度变化明显大于430 nm处的吸光度变化，这反映了LET-R’比LET-R具有更高的消光系数(110max)。LET-I的pKa为6.7，与TME的pH范围吻合良好，表明其具有肿瘤激活能力。此外，在pH 4和9之间的10个循环中观察到最小的变化，表明其pH响应行为具有强大的可逆性。对于FL发射，500 nm处的强度逐渐降低， 820 nm附近的强度随着pH从11降低到6.5逐渐增加。然而，当pH从6.5下降到3.0时，观察到FL信号衰减，并伴有轻微的红移。这一现象可能与LET-I '的聚集有关，随着pH值的降低，LET-I '逐渐聚集形成，FL强度与LET-I '浓度的增加趋势相似。LET-H和LET-I均未检测到PA信号，但LET-H '和LET-I '表现出明显的PA振幅，分别在770 nm和790 nm左右达到峰值。PA强度与浓度呈正线性相关，以及ph依赖性PA振幅也得到证实。此外，LET-H、LET-Cl和LET-Br表现出与LET-I相似的响应行为，其pKa值分别为6.0、6.2和6.2。此外，通过FL光谱进一步测定了pKa (LET-H为6.3,LET-I为6.9)。观察结果表明，卤素原子对C-O键强度的影响不同。在吲哚中对称引入两个碘原子促进了ph响应部分的开环，这可能与具有较大范德华半径的碘原子的未共享电子与邻近π电子云之间的相互作用增强有关。
所有LET-R '在不同的有机溶剂中都表现出典型的花青素吸收。在水溶液中，LET-Cl '和LET-Br '的肩峰明显增加，表明分子聚集。当用Cl、Br或I取代H时，可以观察到吸收和FL发射的色移。虽然随着卤化作用的增加，其最大吸收率降低，但所有ps的最大吸收率仍保持在1.0 × 105 L mol-1 cm-1左右，表明其吸收率较强(表S1)。此外，它们都显示出约20 nm的小Stokes位移和FL发射峰半峰(FWHM)的窄全宽，约40 nm，表明激发态的几何松弛有限。以1,3二苯基异苯并呋喃(DPBF)为1O2探针，对其光敏性进行了评价。在808 nm激光照射(0.2 W cm-2)下，含有DPBF的LET-R溶液在410 nm处的吸光度在100 s内逐渐降低。在4个ps中，LET-I’对DPBF的降解速度最快，其1O2浓度最高(0.65)，而LET-H’的<s:1> 1O2浓度最高(0.33)，表明i取代显著增强了1O2的生成。LET-Cl '显示出了对1O2的降低(0.28)，可能是由于其弱的光子捕获能力。令人兴奋的是，LET-I '表现出比ICG高3.2倍的1O2，表明高效PDT的巨大潜力。相比之下，LET-R表现出ROS生成能力不足。电子自旋共振(ESR)谱显示了激光照射下LET-H '或LET-I '的1O2特征三重态峰。值得注意的是，在照射10分钟后，没有观察到明显的温度升高，这表明在0.2 W cm-2的808 nm激光介导的1O2生成过程中没有光热协同效应。
体外应用
在LET-I '有效生成1O2的激励下，以LET-H为对照，对制备的LET-I进行体外PDT效果的研究。利用聚合物基质增强生物相容性和细胞摄取、提高稳定性和减少不良反应的优势，利用纳米沉淀法将1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3磷酸乙醇胺- n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](dpe - peg2000)包封LET-I或LET-H，分别得到LET-I探针或LET-H探针。两者均呈球形形貌，水动力直径为~125 nm (LET-I探针)和~140 nm (LET-H探针)，多分散性指数(PDI)分别为0.27和0.23。在2周的储存期间，未观察到明显的尺寸变化。测得LET-I探针的Zeta电位为~ - 20 mV, LET-H探针的Zeta电位为- 25 mV。小鼠乳腺癌4T1细胞在4小时内快速摄取LET-I探针。在高PS浓度(20mM)下，两种探针处理的细胞活力均保持在90%，表明它们具有良好的生物相容性。值得注意的是，随着808 nm激光照射时间的延长，细胞存活率逐渐降低。辐照20 min后，LET-I探针仅为25%，明显低于LET-H探针的50%。通过2 '，7 '二氯二氢荧光素双乙酸酯(DCFH-DA)的绿色荧光来验证细胞中ROS的产生。激光照射的LET-I探针组(LETI(+))显示出最强的绿色FL信号，表明ROS生成最高。流式细胞术分析显示，激光照射下，LET-I探针诱导的细胞凋亡率(64.7%)高于LET-H探针(35.2%)。采用数字相衬法进行无标记细胞跟踪，记录14h内4T1细胞增殖、迁移速度和形态的时间过程。LET-I(+)处理的细胞运动轨迹最短，细胞数量明显减少。高通量分析进一步定量证明了LET-I(+)组细胞的移动轨迹最短，不能移位，迁移速度最慢。这些结果共同表明，LET-I加激光照射显著削弱细胞运动。
FL/PA双峰分子成像在体内的高效PDT
为了提高探针在体内的肿瘤靶向性，在LET-I或LET-H的纳米沉淀过程中，将叶酸修饰的DSPE-PEG2000 (DSPE-PEG2000- fa)混合，得到相应的探针LET-I- fa或LET-H- fa。LET-I-FA的稳定性通过随时间变化的大小变化和生物培养基存在下的荧光变化得到证实。给4T1荷瘤小鼠静脉注射LET-I- fa、LET-H-FA或LET-I探针进行FL和PA成像。肿瘤区域的FL和PA信号均随时间逐渐增强。与LET-I探针处理组相比，在注射后24 h, LET-I- fa或LET-H-FA处理组的FL和PA强度要强得多(p.i.)，提示fa增强了肿瘤的积累为了阐明LET-I-FA的酸性tme特异性激活，我们分别将其皮下或瘤内注射到正常小鼠或肿瘤组织中，并将pbs处理的小鼠作为对照。肿瘤区域的FL强度随着时间的推移而增加，而正常组织的FL强度保持不变，导致在20min p.i.时，FLT/N的最大比值为2.5。相比之下，对照组正常组织和肿瘤组织的FL信号变化可忽略不计。PA成像记录了类似的信号变化，在20min p.i时建立了PAT/N = 4的PA开启比。进一步对肿瘤和正常组织进行LET-I-FA多光谱PA成像(680和808 nm)。PA808/PA680比值在肿瘤中升高，而在正常组织中保持不变，进一步验证了LET-I-FA的酸性tme反应特性。测定LET-I-FA的血液循环半衰期(t1/2)为6.35 h。离体FL和PA图像及其定量结果证实，由于FA修饰，LET-I-FA的肿瘤蓄积量更高。
对4t1小鼠进行PDT。将小鼠随机分为7组，每组5只，进行不同的处理。经静脉给药LET-I- fa、LET-H-FA或LET-I探针后，根据体内成像观察，激光照射组于24 h p.i.照射808 nm激光(0.2 W cm-2, 30 min)。14天内各组体重均无明显变化。使用体内US成像监测肿瘤体积。对于LET-I-FA(+)组，肿瘤生长得到有效抑制，优于LET-I(+)和LETH-FA(+)组，进一步验证了LET-I-FA由于FA靶向而具有更高的肿瘤蓄积量，以及由于i取代而产生更高的ROS介导的更好的PDT疗效。不同组离体肿瘤的体积和重量进一步证实了LET-I-FA介导的肿瘤光动力有效根除。为了观察体内ROS的产生，对不同组的离体肿瘤组织进行DCFH-DA染色。与其他组相比，LET-H-FA(+)或LET-I-FA(+)处理组显示出更强的绿色FL信号，表明ROS生成增加。同时，来自LET-H-FA或LET-I-FA本身较强的红色FL信号也证实了fa修饰探针在肿瘤组织中的富集。值得注意的是，尽管LET-H-FA和LET-I-FA的红色FL强度相当，但LET-I-FA(+)处理组的ROS探针信号强度明显更大，进一步表明LET-I-FA比LETH-FA产生ROS的能力增强。最后，通过苏木精和伊红(H&E)、Ki-67和末端脱氧核苷酸转移介导的脱氧尿苷三磷酸刻孔末端标记(TUNEL)染色进行组织学分析，发现LET-I-FA(+)组肿瘤损伤严重，增殖明显减少，细胞凋亡加剧。相比而言，其他主要器官和血液生化未见明显变化，说明LET-I-FA可实现高效的PDT，且具有良好的生物相容性。
结论
我们开发了一系列pH可激活的基于花青素的LW ps (LET-R, R = H, Cl, Br, I)，它们可以在808 nm激光激发下被酸性TME特异性激活产生1O2，实现TME/光双可控肿瘤PDT。利用多种瞬态光谱和DFT计算彻底剖析了这些活化ps (LET-R ')的激子动力学，以阐明潜在的光敏机制。在LET-R '中，LET-I '表现出了较无热辐射的ICG增强的1O2和3.2倍的显著增强，这是由于增加的SOC通道、减小的S1-T1能隙和原子诱导的分子间相互作用的综合作用，从而增强了激子的ISC过程和辐射失活。在体内应用中，探针LET-I-FA可以特异性响应酸性TME，提供高质量的可激活FL/PA双峰分子成像。最终，利用LET-I-FA在超低激光功率密度(808 nm, 0.2 W cm-2)下实现了完全的4T1肿瘤根除。
参考文献
Dissecting Exciton Dynamics in pH-Activatable Long-Wavelength Photosensitizers for Traceable Photodynamic Therapy，Yurong Liu, Jing Zhang, Xuan Zhou, Yaru Wang, Shan Lei, Guangle Feng, Dong Wang, Peng Huang, and Jing Lin*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202408064,https://doi.org/10.1002/anie.202408064
