内容提要
在NIR-II范围内的可激活近红外(NIR)成像对于深层组织生物分析物跟踪至关重要。然而，由于一般化学策略的有限可用性，设计这样的探针仍然具有挑战性。在这里，我们介绍了一个可激活探针的基础平台，利用分析物触发的NIR-II发射罗丹明杂化物的π共轭系统的智能调制。通过调整邻羧基部分的亲核性，我们实现了一种称为“紧推打开和光推锁定”的电子效应，这使得探针在传感之前完成螺旋环化，并且当光推苯胺氨基甲酸酯触发器转化为紧推苯胺时，允许有效的两性离子形成。该平台生产的NIR-II双模成像探针在活小鼠中具有约50倍的荧光和可激活光声信号，超过了报道的通常低于10倍激活信号的探针。为了证明其普遍性，我们成功地设计了过氧化氢(H2O2)和硫化氢(H2S)探针。我们设想在不同的应用中广泛采用化学平台来设计可活化的NIR-II探针。
结果与讨论
调整邻羧基部分为有效的FOLL效应
我们开始使用CS近红外荧光团作为模型，因为它易于合成。考虑到被分析物触发的苯基氨基甲酸酯转化为苯胺的广泛适用性，用于感应酶活性、活性代谢物或金属离子，我们战略性地在荧光团的C5位置上引入了两个取代基:一个给电子较少的NHBoc基团和一个给电子较少的NH2基团。我们的目标有两个:(i)模拟探针在感应目标前后的结构变化，(ii)模拟感应前后荧光团核的不同亲电性。我们的目标是确定一个邻羧基片段，该片段有利于nhboc取代结构的最大螺旋环化(“轻推锁定”效应)和NH2取代的对偶结构的最大两性离子形成(“紧推打开”效应)。
我们首先合成了羧酸作为邻羧基部分的C1化合物。荧光光谱测量显示，NHBoc-C1在近红外范围内的背景信号适中，表明其螺旋环化效率不高，这一范围内的显著吸收进一步支持了这一点。这与羧酸的有限亲核性一致。为了增强螺旋环化倾向，我们将羧基转化为更亲核的n -甲基酰胺。虽然这种转化完全消除了NHBoc-C2近红外范围内的背景荧光，但由于n -甲基酰胺的高亲核性，它阻碍了NH2取代的对偶物中两性离子的形成。
然后，我们通过降低氮原子的电子密度或增加其周围的空间效应来微调酰胺基团的亲核性。这导致合成了另外7对化合物(C3至C9)，并记录了它们的荧光光谱，以及在近红外范围内测量的量子产率。由于传统罗丹明的螺环化两性离子平衡对pH变化很敏感，因此我们测量了NHBoc-和NH2取代化合物在不同pH溶液中的吸收光谱。结果表明，在pH值为4 ~ 9的范围内，它们的吸收强度对pH值的变化是惰性的，表明在该pH值范围内，它们的平衡是相对稳定的。我们使用pH 7.4时NH2/NHBoc对近红外吸收强度的比值，粗略估计了探针平衡在中性和螺环形态之间的变化，并将这些数据与通过高斯计算计算出的酰胺氮原子的电子密度相关联，后者间接测量了亲核性。亲核性最低和最高的羧基基团都导致低信噪比。弱亲核试剂由于螺环化受限，不能有效抑制nhboc取代结构中的背景信号;强亲核试剂由于中性阴离子形成受限，不能在NH2取代结构中获得敏感的荧光信号。在所测试的化合物中，具有邻羧基部分为酰基磺胺的C5对表现出最显著的可激活荧光，与NHBoc-C5相比，NH2-C5的量子产率提高了7倍。
为了进一步验证FOLL效应诱导的高sbr的有效性，我们用三对化合物(C2, C5和C6)对活细胞进行染色，其中nhboc取代的化合物代表传感前的探针，nh2取代的化合物代表传感后的探针。用C6对结构染色的细胞表现出均匀的强荧光，与NHBoc-C6相比，NH2-C6的信号仅增加了1.5倍。
相反，用C2对化合物染色的细胞仍然是非荧光的，与光谱测量结果一致。正如预期的那样，用C5对化合物染色的细胞表现出异常的荧光反应，NHBoc-C5显示出几乎为零的背景信号，NH2-C5显示出明显的荧光(~50倍)。这些发现进一步验证了我们的FOLL策略在设计高荧光探针方面的成功。
调节罗丹明杂化聚甲基染料的NIR-II发射
在确定了合适的邻羧基部分后，我们的下一个目标是优化罗丹明杂化多甲基染料的荧光特性。考虑到NIR-II成像的增强吸引力，我们决定通过调制吲哚部分来微调这些杂交体的发射到NIR-II范围内。我们的策略包括探索硫取代和共轭延伸来设计具有NIR-II排放的荧光团。我们设计了四个结构，并通过Knoevenagel反应合成了它们。在检查它们的吸收、荧光和光声光谱后，很明显，D4表现出最红移的吸收、发射和光声信号，这与Multiwfn软件基于密度泛函理论(DFT)的检查文件在M06-2X/ deff - tzvp级进行几何优化后在B3LYP-D3(BJ)/6-311g(d,p)级计算出的最低LUMO/HOMO能隙一致。
值得注意的是，D4表现出超过900 nm范围的尾巴状吸收和光声强度。考虑到D4在C5位置上有一个羟基取代基，我们假设由于氮原子的给电子能力的提高，D4衍生为苯胺的衍生物可以进一步红移其发射。因此，我们选择D4作为候选荧光团，用于构建我们设计荧光探针的通用化学平台。
荧光NIR-II成像化学平台的研制
我们的下一步是评估C5中酰基磺胺的亲核性与苯胺衍生的D4荧光团的相容性。为了研究这一点，我们合成了含有邻酰基磺胺部分的化合物NHBoc-D4和NH2-D4。通过比较这对化合物的吸收光谱和荧光光谱，我们发现FOLL效应在这个荧光团中比在CS近红外荧光团中表现出更大的功效。NHBoc-D4在近红外范围内几乎为零的吸收和发射，而NH2-D4在近红外范围内则表现出强烈的吸收和荧光。这种趋势对pH值在5 ~ 9范围内的变化几乎是惰性的，表明在该pH范围内平衡是恒定的。与吸收光谱一致，NH2-D4在近红外范围内表现出明显的光声信号，而NHBoc-D4则没有光声信号。这些结果表明，NHBoc-D4(代表传感前的探针)的完全螺旋体化和NH2-D4(代表传感后的探针)的高效两性化。
我们进一步验证了这对结构在活细胞和活小鼠中显著的成像对比度。NHBoc-D4染色的细胞无明显荧光，而NH2-D4染色的细胞有明显荧光;观察到约28倍的荧光信号。同样，将探针注射到活体小鼠肿瘤后，我们在NHBoc-D4组中没有观察到信号，而NH2-D4组显示出明显的信号(约50倍))。我们观察到，静脉注射后，NH2-D4显示出全身分布。在牺牲小鼠并使用NIR-II成像系统检查各器官后，在NHBoc-D4组的器官中未检测到明显的荧光信号。相反，来自NH2-D4组的所有器官都显示出不同的信号，其中肝脏显示出最突出的信号。由于探针的局部浓度不同，两组之间的对比在不同的器官中有所不同。
鉴于NHBoc-D4和NH2-D4在近红外吸收上的鲜明对比，我们假设这种结构有望用于可激活的光声成像。为了验证这一假设，我们对肿瘤内注射探针的小鼠进行了光声扫描。横断面图像显示NHBoc-D4组无信号，而NH2-D4组有标记信号(约50倍)，与荧光成像观察结果一致。
总之，这些数据强烈表明，NH2-D4可以转化为相应的氨基甲酸酯，作为构建高荧光NIR-II探针的理想化学平台。同时实现可激活光声成像。值得注意的是，在100 μM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，NH2-D4对20等量的高氧化物质(如ONOO -和NaClO)的处理是稳定的。这些发现强调了这种化学平台在广泛的生物学应用中的多功能性和潜力。
测试可激活探针设计的化学平台
我们的下一个目标是评估该化学平台用于构建生物分析物成像的可激活探针的实用性。H2O2是活性氧(reactive oxygen species, ROS)的重要成员，在调节细胞增殖、分化和迁移等多种生理过程中起着关键作用。异常的H2O2产生与癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等疾病的病理生理有关。在这项研究中，我们旨在设计一种NIR-II探针用于H2O2的荧光成像。苯基硼酸酯部分作为感知H2O2的化学触发器已经有了很好的历史。因此，我们将NH2-D4荧光团转化为硼氧基氨基甲酸酯。由此产生的探针，记为H2O2-D4，首次证实其在PBS缓冲溶液中的稳定性。然后，测试其对H2O2的响应。H2O2-D4的最大吸收带以500 nm为中心，表明其以螺环形式存在。
与H2O2相互作用后，以500 nm为中心的吸光度下降，同时出现两个以790 nm和900 nm为中心的相邻峰。这一转变表明H2O2触发了两性离子的形成。值得注意的是，吸光度的下降和增加都与H2O2的剂量成正比。我们的动态记录表明，H2O2- d4对H2O2的传感在1小时内完成。
液相色谱-质谱(LC-MS)分析进一步证实了这一观察结果，显示H2O2- d4在与H2O2相互作用1小时内完全转化为NH2-D4。值得注意的是，我们研究了pH值如何影响H2O2- d4感知H2O2的性能。为此，传感反应在各种生物学相关的pH水平下进行。我们观察到探针在测试的pH值水平下仍然是黑色的。而H2O2相互作用后的传感信号随着pH的增加而增强。由于我们已经证实了NH2-D4的螺旋环化-两性离子平衡对pH不敏感，这一观察结果归因于在更基本的条件下探针更有效地转化为NH2-D4，这是由H2O2的反应活性增强和自焚连接体的加速裂解驱动的。此外，我们证实了探针对H2O2的高选择性，因为其他活性物质对其吸收的影响很小。同样，在与H2O2相互作用时，观察到探针的高荧光响应。值得注意的是，由于螺旋环化诱导的NIR-II区域的高效荧光猝灭，H2O2- d4通过补充材料中详细介绍的3SB/K方法可以达到7.0 nM的H2O2检测限。
在基于水溶液的实验中成功评估了探针对H2O2的性能，并确认了其在培养细胞和小鼠中的安全性之后，我们的下一步是使用探针对生物样品中的H2O2进行成像。我们首先用不同浓度的H2O2刺激培养细胞3小时，诱导急性氧化应激。随后，将细胞洗涤，用H2O2-D4染色，并进行成像。在不同浓度的H2O2的作用下，观察到细胞荧光呈剂量依赖性增加。值得注意的是，与阴性对照组相比，在H2O2 (1.0 mM)存在下，细胞探针荧光增加了约15倍。有趣的是，当细胞在H2O2刺激前用ROS清除剂n -乙酰半胱氨酸(NAC)预处理1小时时，观察到细胞探针荧光强度明显降低。我们将研究扩展到涉及百草枯诱导的急性氧化应激的另一个模型。在这种设置中，细胞最初用不同浓度的百草枯处理3小时，然后清洗，用探针染色，随后成像。与H2O2处理组类似，我们观察到细胞探针荧光随不同百草枯浓度的增加呈剂量依赖性。综上所述，这些结果表明H2O2-D4具有通过荧光信号评估细胞氧化应激水平的能力，从而为监测活细胞中的氧化应激动态提供了有价值的工具。
基于在细胞研究中获得的有希望的结果，我们开始评估H2O2- D4在异种移植4T1肿瘤小鼠模型中成像H2O2的可行性。我们首先证实BLT NIR-30F系统记录的NH2-D4的荧光强度与其浓度成正比。然后，进行实时NIR-II荧光成像，监测和量化肿瘤内给药后活体小鼠肿瘤内H2O2激活探针荧光信号的增强。记录7小时后，肿瘤部位的NIR-II荧光约为背景的50倍，这是迄今为止报道的最高SBR。此外，我们探索了探针在H2O2活化光声成像中的适用性。与NIR-II荧光成像结果相似，我们观察到小鼠肿瘤部位的光声信号随时间增加，几乎没有背景信号干扰，8小时后SBR达到50。H2O2- d4在小鼠肿瘤中H2O2显像的成功，激发了我们进一步研究其在药物性肝损伤中H2O2上调显像的作用，这是临床实践和药物开发中关注的一个重要问题。曲唑酮与罕见的肝损伤病例有关，但其机制在很大程度上仍不清楚。有报道称氧化应激可能在这一过程中发挥作用。为了研究曲唑酮是否上调小鼠肝脏H2O2水平，在曲唑酮处理后小鼠静脉注射H2O2- D4，并在给药前后分别拍摄NIR-II荧光和光声图像。数据所示，两组小鼠在两种成像方式下肝脏信号均逐渐增强，曲唑酮组增强趋势更为明显。值得注意的是，曲唑酮组与载药组在光声模式下的成像对比尤为明显。这表明H2O2- D4对小鼠肝脏的生理H2O2具有足够的敏感性，曲唑酮可导致小鼠肝脏中H2O2的上调。它还突出了我们的双模激活成像策略的优势。以上细胞和小鼠成像结果强调了我们的化学平台在设计超荧光和可激活光声探针方面的适用性。这为实现各种生物分析物的多模态成像开辟了可能性，进一步提高了我们精确和多功能生物成像应用的能力。
化工平台探针设计的通用性
受H2O2-D4成功应用的鼓舞，我们开始探索我们的化学平台在设计可活化NIR-II探针方面的普遍适用性。其中一个重要的靶分子是H2S，它是生命系统中的一种内源性气体信号分子，在各种生理过程中起着关键作用。H2S高荧光成像的前景有望获得对其病理生理的有价值的见解。在这种情况下，我们通过在NH2-D4荧光团上引入H2S响应触发器，开发了一种H2S传感探针，标记为H2S-D4。这种探针在PBS溶液中的稳定性首先得到了证实。
我们最初的研究旨在评估探针对水溶液中H2S的传感性能。吸收光谱显示H2S-D4在近红外光谱范围内没有表现出明显的吸收，这表明H2S-D4更倾向于螺环形式。然而，暴露于H2S后，我们观察到近红外吸收的剂量依赖性增强，表明向两性离子形式转变。这种转化也与孵育时间有关。H2S- d4对H2S的反应对pH值在5 ~ 8之间的变化不敏感。此外，我们证实了探针对H2S的高选择性，与苯基肼部分对H2S的选择性一致。与吸收分析平行，荧光光谱测量显示H2S诱导探针的显着荧光响应，检测限确定为23 nm。为了更深入地了解探针对H2S的传感过程，我们使用了高效液相色谱(HPLC)分析，为H2S触发氨基甲酸酯探针转化为NH2-D4荧光团提供了额外的支持。
H2S-D4对培养细胞和小鼠均无明显毒性。随后，我们评估了其在活细胞中对H2S进行荧光成像的可行性。细胞首先用NaHS (1 mm)作为H2S供体处理3小时，进行H2S- D4 (5 μM)不同时间的染色，然后成像。结果显示染色时间依赖性细胞探针荧光增强，表明细胞H2S-D4持续转化为NH2-D4。在另一个实验中，细胞用不同剂量的NaHS(0、0.5和1 mM)处理3小时，然后用H2S-D4孵育90分钟，然后成像。细胞探针荧光信号以NaHS剂量依赖的方式增强，表明其能够响应活细胞中不同的H2S浓度。然后，我们测试了其在内毒素诱导的急性炎症过程中对H2S成像的性能。据报道，脂多糖(LPS)在小鼠体内产生剂量和时间依赖性的H2S上调。为了检查H2S-D4是否会跟踪这一过程，我们将LPS和l -半胱氨酸(L-Cys)腹腔处理的小鼠静脉注射H2S-D4，并记录NIR-II荧光和光声信号。LPS组表现出更明显的时间依赖性信号增强，光声模式下的信号在两组之间表现出更好的对比。这表明H2S- D4探针对内源性H2S生成具有足够的敏感性。
综上所述，H2S- D4可以通过其敏感的荧光信号有效评估生物H2S。该探针的成功不仅强调了它的实用性，而且意味着我们设计NIR-II探针的化学平台的通用性和多功能性。这种探针具有实现各种酶、活性代谢物和其他病理靶点的荧光成像的潜力，进一步拓展了生物医学研究和诊断的视野。
结论
为了利用邻羧基基团调节的螺旋环化-两性离子平衡作为可活化近红外探针的有效设计原则，我们将分析物触发的电子效应与邻羧基部分的亲核性结合起来进行了系统研究。我们使用罗丹明杂化物作为模型化合物，在检测生物靶标之前，我们使用5-NHBoc取代衍生物来模拟探针，5-NH2取代衍生物代表检测后的产物。通过精心调整邻羧基部分，我们确定了一个理想匹配的电子效应-用力推动打开和轻推锁定。这种效应确保了探针在感应前的最佳螺旋环化和感应后的最大两性离子特性。该平台代表了设计可激活NIR-II探针的直接方法，实现了NIR-II光谱的双模成像。重要的是要承认，尽管我们的研究在设计可活化的NIR-II探针用于生物分析物方面取得了有希望的结果，但未来的改进仍有一定的局限性。我们探索的分析物的范围仍然有限。我们主要关注H2O2和H2S探针作为概念验证的例子。未来的研究应该在这个平台上扩展，以涵盖更广泛的目标和分析物，增强其多功能性和实用性。
参考文献
A firm-push-to-open and light-push-to-lock strategy for a general chemical platform to develop activatable dual-modality NIR-II probes， Lili Shen, Jian Li, Chenglong Wen , Hao Wang , Nian Liu , Xinhui Su , Jianzhong Chen , Xin Li *，Sci. Adv. 10, eado2037 (2024) ，
