内容提要
肿瘤微环境的准确可视化对个体化医疗具有重要意义。在这里，我们开发了一种近红外(NIR)荧光/光声(FL/PA)双模分子探针(标记为NIR-CE)，用于通过分析物诱导的分子转化(AIMT)策略来区分基于羧酸酯酶(CE)水平的肿瘤。CE活性的识别部分是NIR-CE的乙酰基单元，生成前产物NIR-CE- OH, NIR-CE- OH在吲哚基的氮原子和酚羟基之间进行自发的氢原子交换，最终转化为NIR-CE-H。在细胞实验和体研究中，近红外荧光成像和PA成像均能成功区分人肝癌细胞和高水平CE的肿瘤。我们的发现为个性化治疗指导提供了新的分子成像策略。
结果与讨论
探针的光物理性质研究
合理设计了半花青碱探针NIR-CE和NIR-CE-OH，分别通过商品吲哚和1h -杂蒽-4-甲醛在乙酸酐或乙醇中易得反应合成。测试了探针NIR-CE和NIR-CE- oh在不同溶剂中的吸收和发射光谱。然后，研究了NIR-CE和NIR-CE- oh的pH响应性。在碱性溶液中，NIR-CE探针在468 nm处有主吸收峰。两个新的吸收峰在595和635海里出现pH值从7.4到5.0,这给pKa 5.55,由于氮原子的质子化作用NIR-CE形成NIR-CE-H。至于另一个探测器NIR-CE-OH,有四种形式的可互换的分子在不同pH值的解决方案由于两个pH-responsive官能团,吲哚组和上的氮原子上的酚羟基蒽组。在酸性溶液(pH = 3.0),在pH 3.0 ~ 7.5范围内，NIR-CE-2H在654 nm处有一个主吸收峰，该吸收峰逐渐减弱并移至676 nm处;在488 nm处出现了一个新的吸收峰，这是NIR-CE-2H向NIR-CE-OH和NIR-CE-H的转化所致。NIR-CE-H和NIR-CE-OH分别在676和488 nm处的吸收峰。与NIR-CE-OH相比，NIR-CE-H具有更强的推拉电子系统，最大吸收波长更长。从pH 7.5到pH 10, 676 nm处的吸光度逐渐降低，548 nm处的吸光度增加，这是NIR-CE-2OH的作用。同时，不同pH溶液中的FL光谱和颜色变化结果也展示了NIR-CE-OH的转化过程。不同pH溶液(pH 4.0和pH 7.4)下的激发和发射光谱表明，当激发波长为655 nm时，NIR-CE-2H的最大发射峰为683 nm，而当激发波长为690 nm时，NIR-CE-H的最大发射峰为708 nm。此外，无论是在690 nm还是655 nm激发，NIR- ce都表现出较弱的近红外荧光发射。这些结果表明NIR-CE-OH和NIR-CEH在生理条件下可以相互转化，为AIMT策略的设计提供了前提条件。
探针的响应研究
在上述结果的鼓舞下，我们对探针NIR-CE的CE响应性能进行了体外评价。NIR-CE在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中，主吸收峰位于468 nm处。654 nm处的吸收强度逐渐降低，并向488 nm处转移，而在CE存在下，随着孵育时间的增加，在676 nm处出现了新的吸收峰，表明探针NIR-CE具有良好的CE响应特性。NIR-CE经CE酶解后，由前产物NIR-CE- oh (488 nm)自发形成终产物NIR-CEH (676 nm)，并在60 min内达到平衡，由676 nm处的吸收变化确定，说明NIR-CE探针可以通过AIMT策略用于CE检测。同时，观察到溶液颜色从黄色到灰色的明显变化，可以用肉眼比色法检测CE。通过高效液相色谱(HPLC)分析和高效液相色谱-质谱(HPLC - ms)验证了探针NIR-CE触发的酶解。在PBS缓冲液中加入不同浓度的CE后，676 nm处的吸收强度和708 nm处的吸光强度逐渐增大，吸光强度比(I708/I0)与CE浓度在0 ~ 5 μg/mL范围内呈线性正比关系，说明NIR-CE对CE具有较高的灵敏度，检出限(LOD, 3σ/斜率)低至26 ng/mL。同时，684 nm处PA信号的增加也说明了PA成像可以检测CE。此外，还研究了CE催化探针NIRCE水解的动力学参数。，Km = 34.92 μM, Vmax=0.82 μM -1, Kcat=4.12 s-1, Kcat/Km =1.18 × 105 M-1 s-1，周转量(TON)为706，与文献一致。
然后，我们研究了人血清白蛋白(HSA)对NIR-CE和CE之间催化反应的影响。探针NIR-CE在HSA (50 mg/mL)溶液中孵育30分钟后吸收和发射光谱保持不变。CE加入后，逐渐出现676 nm处的吸收峰和708 nm处的发射峰，说明NIR-CE与CE的催化反应没有受到HSA的干扰。此外，采用计算模拟来评估NIR-CE与CE或HSA之间的结合亲和力。结果表明，与HSA相比，探针NIR-CE与CE蛋白具有更高的亲和力。我们还检测了探针NIR-CE对其他干扰物质的响应，包括对氧磷酶(PON)和丁基胆碱酯酶(BChE)。这些物质的存在对吸收光谱和荧光光谱的影响很小，表明探针NIR-CE对CE检测具有特异性。同时，NIR-CE具有较高的光稳定性，光热效应可以忽略不计，光动力效应极弱。随着时间的推移，NIR-CE在PBS或细胞培养等不同培养基中也表现出良好的稳定性。以上数据表明FL/PA双模探针NIR-CE通过AIMT策略检测CE具有很高的灵敏度和特异性，这是复杂生物系统下精确检测所需要的。
细胞中对CE的检测
我们通过对不同类型癌细胞内源性CE的检测来研究探针NIR-CE的有效性。本研究以MDA-MB-231和HepG2细胞为模型细胞系。在研究之前，我们评估了NIR-CE和NIR-CE- oh对MDA-MB-231和HepG2细胞的细胞毒性。即使NIR-CE或NIR-CE- oh浓度达到200 μM，细胞存活率仍保持在90%以上，表明它们具有良好的生物相容性。然后比较MDA-MB-231和HepG2细胞的CE水平。与NIR-CE孵育后，HepG2细胞的FL强度随着时间的推移逐渐增加，这是由于CE与NIR-CE的催化反应，形成NIR-CEOH，然后自发转化为NIR-CE- h。而MDA-MB-231细胞中几乎没有明显的FL信号。与MDA-MB-231细胞组相比，NIR-CE孵育12 h后，HepG2细胞组的FL增强约5.5倍。同时，用抑制剂(双(对硝基苯)磷酸)预处理HepG2细胞，FL强度明显降低。同时，探针NIR-CE可以检测不同类型细胞中不同水平的CE浓度，包括HepG2、MDA-MB-231、Huh-7、A431和A375。这些结果表明，HepG2细胞中的CE水平高于MDA-MB-231细胞，这也得到了商用试剂盒分析的证实。为了进一步研究NIR-CE在亚细胞细胞器中的位置，我们利用NIR-CE对HepG2细胞进行染色，并以商用细胞器跟踪剂为参考。这些结果表明，NIRCE主要分布于内质网。这些结果清楚地表明CE在HepG2细胞中过表达，探针NIR-CE有可能作为区分不同CE水平癌症的报告基因。
活体中CE的检测
接下来，我们研究了NIR-CE在HepG2和MDA-MB-231荷瘤小鼠体内的FL和PA成像。在瘤内注射NIR-CE探针(200µM, 50µL)后，HepG2肿瘤区域的FL强度随时间逐渐增加，在8 h达到最大值，而MDA-MB-231和HepG2+Inhibitor荷瘤小鼠肿瘤区域未见明显的FL或PA信号。在注射后2 h和1 h，探针NIR-CE的FL和PA信号可以有效区分不同类型的肿瘤。HepG2组离体肿瘤组织显示较强的FL强度，与市售试剂盒结果一致。定量分析表明，注射探针NIR-CE 8 h后，HepG2组体内肿瘤区域的FL强度分别比MDA-MB-231组和HepG2+Inhibitor组高7.8倍和8.5倍。与PBS组相比，NIR-CE组主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的苏木精和伊红(H&E)染色图像未见病理损伤，表明探针NIR-CE具有良好的生物安全性。这些结果清楚地表明HepG2和MDA-MB-231肿瘤之间存在CE水平的差异，通过AIMT策略使用FL/PA双模探针NIR-CE可以有效地实时可视化。
为了进一步评价探针NIR- ce在AIMT策略下的性能，我们设计了一项通过近红外FL和PA成像区分HepG2和MDA-MB-231荷瘤小鼠的盲法研究。首先，将HepG2或MDA-MB-231细胞植入一组balb/c裸鼠。然后另一名研究人员给它们贴上标签并随机分组。在研究结束前，他们的身份都是保密的。接下来，当肿瘤达到~100 mm3时，对6只小鼠瘤内给予NIR-CE。在接下来的8小时内，通过近红外荧光和PA成像评估CE水平。2只小鼠(小鼠3和小鼠6)由于FL和PA信号较强，我们将其归类为“分层1组”，我们认为这是高CE水平的HepG2荷瘤小鼠。其余4只小鼠分为“分层组2”，由于CE水平较低，我们将其命名为MDA-MB-231荷瘤小鼠。在揭示了小鼠的身份后，我们发现我们的识别在每一个例子中都是准确的，置信度为100%。这些结果表明，AIMT探针NIR-CE可以基于无创实时FL/PA成像为不同癌症提供个性化的医学指导。
总结
我们通过AMIT策略成功开发了FL/PA双模分子探针NIR-CE，该探针在体外和体内对CE都具有高特异性和高响应性。NIR-CE的乙酰基单元作为CE活性的识别片段，生成预产物NIR-CE- oh，在吲哚基氮原子与酚羟基之间发生氢原子自发变化，最终成为NIR-CE- h，导致FL和吸收信号发生变化。此外，在一项盲法研究中，基于近红外FL和PA成像，高CE水平的HepG2肿瘤可以成功区分低CE水平的MDA-MB-231肿瘤。本研究为基于CE水平的AMIT策略区分微环境中不同生物标志物表达水平的肿瘤提供了一种新的分析方法。因此，基于分析物和生物标志物的后续个性化治疗计划设置可以在图像传感指导下进行。
参考文献
Carboxylesterase Activatable Molecular Probe for Personalized Treatment Guidance by Analyte-Induced Molecular Transformation ，Benhao Li, Hengke Liu, Mengyao Zhao, Xinming Zhang, Peng Huang,Xiaoyuan Chen* and Jing Lin*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202404093， https://doi.org/10.1002/anie.202404093
