内容提要
准确的术中肿瘤是成功手术结果的关键。传统技术特异性差、灵敏度低、耗时长，极大地影响了术中决策。在这里，我们报道了一种级联激活的近红外荧光(NIRF)探针IR780SS@CaP，它可以依次响应肿瘤酸度和谷胱甘肽水平升高，从而准确定位术中肿瘤。与非激活探针和单因素激活探针相比，IR780SS@CaP级联策略可以在复杂的生物环境中最大限度地减少非特异性激活和假阳性信号，提供优越的肿瘤与正常组织的比例，以促进腹部转移的描绘。直径小于1mm的小转移性病变可以通过IR780SS@CaP精确识别，并在NIRF成像指导下完全切除。本研究可为肿瘤诊断和影像引导下的肿瘤手术提供实时信息和可靠的决策支持，从而降低复发和并发症的风险，改善患者治疗效果。
结果与讨论
IR780SS@CaP探针的级联响应研究
IR780SS@CaP探针主要由超敏感的CaP外壳和具有GSH敏感二硫键的NIRF染料IR780SS组成。IR780SS在750 nm处有一个发射峰，在640 nm处有一个激发峰。然而，在CaP壳内封装后，由于ACQ效应，IR780SS的荧光被显著猝灭。当暴露于酸性微环境时，探针快速分解并导致IR780SS释放。随后，带正电荷的IR780SS很容易进入肿瘤细胞，并被细胞内GSH还原为硫醇形式，进一步进行重排以产生更稳定的IR780SS。这将使探针的峰值发射从750 nm移动到810 nm(为了便于比较，我们直接用2-巯基乙胺中的硫原子亲核取代IR780中的氯，合成了小分子IR780S。此外，IR780SS的光学性质在轻度酸性条件下几乎没有变化。IR780SS@CaP在4-(2-羟乙基)哌啶-1-乙磺酸(HEPES)缓冲液、培养基(pH 7.4)和10% FBS培养基中37℃下12 h的水动力直径几乎保持不变，表明其在生理介质中具有良好的稳定性。此外，IR780SS@CaP和IR780S在808 nm激光照射下均表现出良好的光稳定性，有利于术中成像。
为了研究IR780SS@CaP的pH响应性，我们首先监测了探针在pH 5.85−7.4范围内的荧光光谱。随着pH值的降低，750 nm处的发射强度逐渐增加，表明pH诱导的IR780SS释放在0.2 (pH 6.8 ~ 7.0)的狭窄pH范围内，与肿瘤微环境的细胞外pH完全匹配。值得注意的是，当探针在775 nm, pH为6.8时，810 nm处的发射峰比pH为7.4时略有增强，这表明酸性肿瘤微环境可以开启810 nm处的荧光信号。此外，一旦开启810 nm的荧光，释放的IR780SS的信号强度表现出gsh依赖性的增加。在对应的吸收光谱中可以观察到gsh激活的波长红移。IR780S和IR780SS对应的800 nm和645 nm吸光度之比随GSH的增加而线性增加。因此，IR780SS在795 nm处的PA信号增强。上述结果表明IR780SS@CaP可能响应肿瘤细胞外pH和细胞内GSH，并在810 nm处引发荧光和PA信号的显著增强。
为了进一步测试IR780SS@CaP对酸性和GSH的顺序响应，我们制备了IR780S@CaP(单酸性可激活探针)、SiO2- IR780SS(单GSH可激活探针)和SiO2 - IR780S(非激活探针)作为对照探针。对于最后两种探针，IR780SS或IR780S以共价方式附着在SiO2纳米颗粒表面。透射电子显微镜(TEM)结果显示，这些探针都是球形纳米颗粒，尺寸相当。正如预期的那样，当pH从7.4降低到6.8时，球形的IR780SS@CaP和IR780S@CaP解离成不规则的小碎片。SiO2- IR780SS和SiO2 - IR780S的形貌基本保持不变。然后，将IR780SS@CaP探针和对照探针分别在含GSH或不含GSH的磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH = 7.4或6.8)中孵育，并在810 nm处监测荧光。对于IR780SS@CaP探针，酸性和谷胱甘肽作为单一刺激都不能激活810 nm的荧光。只有当酸度和谷胱甘肽作为双键以特定顺序呈现时，信号才能有效开启。相反，IR780S@CaP的荧光只能由代谢酸性触发，而与GSH的添加无关，而SiO2−IR780SS无论是否存在酸性条件，都只表现出GSH激活的信号放大。SiO2 - IR780S的荧光信号几乎不受酸度和GSH的影响，因为它不含任何响应基序。四种探针的不同响应行为在定量分析结果中得到了一致的反映。IR780SS@CaP对酸性和谷胱甘肽均有反应时，荧光增强显著(98倍)。此外，IR780SS@CaP的吸收光谱和PA信号也呈现出一致的变化。所有这些结果表明IR780SS@CaP确实具有双重病理参数的激活能力，可以作为具有信号放大的级联激活探针用于高度特异性和敏感性的肿瘤成像。
细胞中IR780SS@CaP探针的级联响应研究
我们在培养的细胞系中探索了IR780SS@CaP对酸性和谷胱甘肽的级联反应。分别用IR780SS@CaP探针和对照组处理乳腺癌4T1细胞。在不同pH和GSH条件下，用活体动物成像系统(Live animal imaging system, IVIS)记录810 nm的荧光信号。为了更好地研究探针的酸度和GSH响应能力，我们使用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-DG)和GSH清除剂n -乙基马来酰亚胺同时或单独处理4T1细胞。在SiO2 - ir780s处理的细胞中，荧光强度几乎没有变化。然而，对于单响应探针SiO2 - IR780SS和IR780S@CaP，如果相应的GSH或酸性相被阻断，信号的可见性要小得多。更有趣的是，一旦酸度被阻断，级联探针IR780SS@CaP的荧光几乎看不到。仅阻断GSH后，4T1细胞出现微弱信号，可能是因为释放的IR780SS向IR780S的转化受到抑制。然而，当酸性和GSH同时被阻断时，细胞中IR780SS@CaP的荧光几乎检测不到，这加强了酸性和GSH在IR780SS@CaP活化中的协同作用。进一步的定量分析一致地揭示了IR780SS@CaP对酸性和GSH的级联反应性，这也得到了PA成像结果的支持。此外，与单激活探针相比，级联失激活IR780SS@CaP探针更有可能在复杂的生物环境中确保高特异性的肿瘤成像，因为它不能在酸度和GSH顺序出现之前被激活。受上述结果的鼓舞，我们接下来评估了IR780SS@CaP在体内的顺序反应性。在此之前，通过细胞毒性研究、苏木精和伊红(H&E)染色、血液生化和免疫毒性等多种生理指标评估IR780SS@ CaP的生物安全性。未观察到对主要器官的明显毒性和损伤，表明IR780SS@CaP具有良好的生物相容性。然后将IR780SS@CaP静脉注射到4T1荷瘤小鼠体内(每组5只)，记录810 nm处的发射强度。肿瘤部位的荧光逐渐增强，并在12 h时达到最大值，说明IR780SS@CaP在肿瘤组织中有效积累和激活。同时，该信号在非肿瘤区域几乎不可见，极大地有利于更具体的肿瘤定位。肿瘤区域PA信号随荧光强度呈一致的变化趋势，这也说明注射后12 h, IR780SS@CaP达到肿瘤最大蓄积，可以进行手术切除。
IR780SS@CaP对肿瘤的可视化研究
为了综合评价IR780SS@CaP实时肿瘤可视化的能力，将IR780SS@CaP和另外三种对照探针(IR780S@CaP、SiO2−IR780SS和SiO2−IR780S)分别静脉注射到4T1荷瘤小鼠体内。，虽然单激活探针IR780S@CaP和SiO2 - IR780SS在一定程度上比分布在全身的非激活探针SiO2 - IR780S具有更高的肿瘤成像能力，但来自正常组织的强非特异性信号仍然明显，提示其在动态复杂的生理环境中的易感性。相比之下，IR780SS@CaP在注射后4小时将肿瘤清晰地描绘为暗背景下的亮点，表明IR780SS@CaP具有高灵敏度和特异性区分肿瘤与正常组织的明显能力。进一步的定量分析显示IR780SS@CaP探针在肿瘤中产生的T/ N比远高于其他对照组。IR780SS@CaP组在注射后12小时(T/N比~ 17)达到最大对比度，而不可激活探针在肿瘤中的荧光增加最小(T/N比~ 3)。注射后牺牲小鼠的肿瘤和主要器官的离体成像也证实了IR780SS@CaP优于其对应物的成像性能。IR780SS@CaP具有很强的肿瘤识别能力，可能是由于酸性肿瘤微环境和细胞内GSH对IR780SS@CaP的顺序激活。这样可以有效抑制非特异性激活的干扰背景，对手术中确定肿瘤边缘有很大的帮助。
为了进一步验证IR780SS@CaP在体内是否对肿瘤酸度和GSH有顺序反应，我们在IR780SS@CaP给药前分别或同时注射2-DG和甲酰基马来酰亚胺给药4T1荷瘤小鼠，考察其对IR780SS@CaP肿瘤显像效果的影响。在酸性和谷胱甘肽同时存在的情况下，可以清晰地观察到聚焦在肿瘤部位的强烈荧光信号。而在纯酸性条件下，8 h后只出现一个非常微弱的信号，说明释放的IR780SS由于GSH不足而没有有效转化为IR780S。单纯谷胱甘肽和正常情况下，肿瘤区域无可检测信号。这些结果表明，酸性是IR780SS@CaP激活的先决条件，GSH负责进一步的信号增强。正如我们所料，IR780SS@CaP探针确实对酸度和GSH有特定的响应顺序，相同条件下PA信号的变化也证实了这一点。
IR780SS@CaP在腹膜癌小鼠模型对肿瘤的检测
在证实IR780SS@CaP对皮下4T1肿瘤的显像能力后，我们通过将表达荧光素酶的4T1细胞直接接种腹腔，进一步验证了其在腹膜癌小鼠模型中检测肿瘤病变的有效性。将IR780SS@CaP和对照探针(IR780S@CaP, SiO2 - IR780SS和SiO2 - ir7800s)静脉注射到腹膜癌小鼠体内12小时后，进行剖腹手术和NIRF成像。在高T/N比(~ 7−10)的腹膜表面明显检测到IR780SS@CaP的强荧光。H&E染色进一步证实了荧光信号具有高度的肿瘤特异性，验证了IR780SS@CaP特异性识别转移性肿瘤的有效性。肿瘤与正常组织之间的分界线表明IR780SS@CaP识别肿瘤边缘的可靠性。肿瘤组织的平均荧光信号明显高于健康组织。此外，计算灵敏度、特异性和精度均为100%。虽然其他三种探针也照亮了腹膜上的几个组织，但荧光信号与H&E染色结果的对应性不佳，导致灵敏度、特异性和精度远低于IR780SS@CaP。使用受试者工作特征(ROC)分析来评估这些探针的性能。我们确定IR780S@CaP、SiO2@IR780SS和SiO2@IR780S的曲线下面积(AUC)分别为0.83、0.78和0.68，而级联探针IR780SS@CaP对肿瘤组织的鉴别准确度较高(AUC = 1.00)。
IR780SS@CaP优越的肿瘤特异性促使我们研究其在腹部转移的准确术中成像和图像引导肿瘤切除中的潜力。，荷瘤小鼠腹腔多个部位被IR780SS@CaP以高T/N比激活。在荧光成像的指导下，这些亮点从小鼠身上去除。对切除组织的生物发光成像和进一步的H&E染色分析证实，通过IR780SS@CaP可以精确识别所有转移灶，包括直径小于1mm的转移灶。IR780SS@CaP在术中如此准确的肿瘤识别可能得益于其双锁级联激活特性，有效降低了复杂生理环境下非特异性激活的干扰背景。
总结
我们提出了一种双级联可激活的NIRF探针IR780SS@CaP，它可以连续响应细胞外酸度和GSH水平升高的肿瘤病理状况，用于高度特异性的肿瘤成像和图像引导手术。在血液和正常组织中，IR780SS@CaP的荧光由于ACQ效应而保持沉默。然而，当到达酸性肿瘤微环境时，信号屏蔽体CaP分解，产生近红外染料IR780SS，通过肿瘤细胞中GSH水平的升高，IR780SS可进一步降为IR780S，在810 nm处产生强荧光，导致荧光信号级联扩增。同时，这种结构转变也将探针的吸收带移至近红外区，有效激活了PA信号。与非激活探针和单酸性/谷胱甘肽激活探针相比，双级联激活IR780SS@CaP探针在体外可以提供更高的对比度增强(98倍)。此外，双级联可激活IR780SS@CaP探针在体内可有效减少非特异性激活，获得更高的T/N比(17比3)。IR780SS@CaP不仅能在小鼠模型中突出显示皮下4T1肿瘤，还能以100%的精度和100%的特异性检测腹部转移灶，极大地有利于术中肿瘤的描绘和切除。我们的研究结果提供了一种通过多种病理参数开发可协同激活探针的策略。IR780SS@CaP可以应用于多种肿瘤模型，因为细胞外酸度和GSH升高已被认为是实体瘤的标志，无论其细胞或组织起源如何。
参考文献
A Dual-Cascade Activatable Near-Infrared Fluorescent Probe for Precise Intraoperative Imaging of Tumor , Yanbin Feng, Haohao Yan, Xiaocheng Mou, Zuo Yang, Chaoqiang Qiao, Qian Jia,* Ruili Zhang,* and Zhongliang Wang* ， Nano Lett. 2024, 24, 6131−6138，https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.4c01364
