内容提要
荧光传感在研究生物过程和疾病诊断中具有重要意义，特别是在背景信号较低的第二近红外窗口。然而，当传感波长延伸到NIR-II区域以获得更高的成像对比度时，构建“off-on”传感器仍然是一个很大的挑战，这主要是由于光谱重叠猝灭剂的合成困难。在此，我们提出了一种新的荧光猝灭策略，利用位阻猝灭剂(SHQ)来调节荧光团的分子填充状态并抑制发射信号。大SHQ可以与荧光团竞争性地包装并阻止它们的自聚集。基于这种猝灭机制，通过生物分析物对SHQ的响应性失效，实现了一种新的可激活的“off-on”传感方法，即位阻失效产生发射(SHINE)策略。ClO-敏感的SHQ导致癫痫小鼠颅骨下海马和高光子散射脑组织中明亮的NIR-II信号释放，提供了活的癫痫小鼠ClO-生成过程的实时可视化。
实验结果与讨论
分子设计与光物理性质研究
构建具有AIE特征的NIR-II荧光染料的代表性设计策略通常采用苯并双噻二唑(BBTD) 作为强电子受体;和TPA或TPE类似物作为强电子供体。鉴于BODIPY染料优异的光学性能，本文提出构建具有AIE特征的NIR-II BODIPY染料ANB作为分子填充状态报告分子，其中以Aza-BODIPY核为电子受体，以具有给电子和旋转性质的TPA和TPE为电子给体。同时，设计了一种结构相似的NIR-II BODIPY染料(NB)作为比较。ANB和NB的吸光度范围为600 ~ 850 nm，峰值为685/775和655/745 nm。两亲性mDSPE-PEG2000(1,2二硬脂酰-sn-甘油-3磷酸乙醇胺- n-[甲氧基])经过PBS后ANB的高量子产率(0.13%)。然后通过监测乙腈/水混合物中的荧光发射光谱，研究了ANB和NB的聚集。ANB在良好溶剂乙腈中表现为裸荧光信号，而将不良溶剂水的比例从10%增加到90%后出现18.5倍的强荧光信号，表现出典型的AIE性质，ANB分子逐渐形成堆积态。相比之下，不含TPE片段的NB表现出较弱的AIE特性，荧光增强仅为5倍。这些结果表明，对于Aza-BODIPY结构染料，引入强给电子基团TPA只能使染料实现NIR-II荧光发射，需要进一步引入旋转基团TPE才能实现显著的AIE特征，使ANB具有反映分子包装状态的能力。为了证明我们的假设，具有较大立体结构的位阻分子可以阻止AIE分子聚集，从而抑制荧光，我们设计并合成了一系列具有不同立体结构的位阻猝灭剂(SHQ-1~5)并在两亲性mDSPE-PEG2000中以不同的摩尔比与ANB共包封。正如预期的那样，当与小立体化学SHQ-1和SHQ-2共包被ANB时，几乎没有观察到ANB荧光的抑制，说明SHQ-1/2对ANB包装的影响可以忽略。尽管SHQ-3~5的吸光度与ANB的发射光谱之间没有重叠，但随着SHQ/ANB摩尔比的升高，ANB的荧光强度持续而明显地降低。特别是在ANB-SHQ-5传感器中，当SHQ/ANB摩尔比达到5时，发射强度淬灭84%。这些光谱结果有力地支持了我们的位阻猝灭方法假设，并为随后基于位阻猝灭机制构建高灵敏度的“off-on”传感器提供了可能性。
基于SHINE的ClO-传感器研究
基于位阻猝灭方法，我们进一步开发了相应的“off-on”传感器，即位阻失效产生的发射(SHINE)传感器，其中“on”信号是由SHQ的失能引起的。结合大空间位阻效应和ClOresponsiveness, SHQ-6被设计并与ANB共封装构建NIR-II SHINE传感器(ANB-SHQ-6)。在研究ANB-SHQ-6的响应性能之前，我们首先通过DFT计算研究了SHQ-6的空间位阻能力。与ANB二聚体相比，ANB与SHQ-6的分子距离更短(3.9 Å)，相互作用更强(-9.7 kcal/mol)，说明SHQ-6具有很强的位阻作用，可以阻止ANB聚集，抑制ANB的荧光发射。为了进一步验证SHQ-6的荧光猝灭能力，我们构建了一系列ANB-SHQ-6传感器，ANB/SHQ-6的摩尔比为0.2 ~ 15。随着SHQ-6摩尔比的增加，传感器的荧光发射逐渐降低，说明SHQ-6成功调节了ANB分子的堆积状态，抑制了荧光发射。特别是具有95%荧光猝灭能力的ANB/SHQ-6，选择1:4的比例构建SHINE传感器，用于后续的生物应用。然后，评估ANB-SHQ-6传感器的ClO响应性。添加0 ~ 160 μM的ClO后，NIR-II荧光发射在2 min内逐渐恢复，最终增强18倍，检出限(LOD, 3σ/斜率，σ为11个空白重复的标准差)为96 nM，与文献报道相当。这些结果表明，SHQ-6的失效诱导ANB分子重新包装，最终形成聚集状态并释放荧光信号。同时，我们还考察了ANB-SHQ-6传感器对氨基酸、还原剂、金属离子等干扰物质的传感选择性。这些物质的存在对荧光变化影响不大，证实了ANB-SHQ-6传感器的高特异性，为生理条件下的传感提供了潜力。
体外ClO-传感研究
由于NIR-II SHINE ANB-SHQ-6传感器的体外传感性能和高稳定性，我们进一步研究了其监测人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞内ClO的能力。根据前人的研究，分别用浓度为0 ~ 15 μM的ClO -溶液和脂多糖(LPS)作为外源性和内源性ClO -刺激HUVEC。通过自制的NIR-II显微镜观察，pbs处理的活细胞中NIR-II信号一致且相对较低，说明了ANB-SHQ-6传感器在正常生理微环境下的高稳定性。随着ClO -的加入，NIR-II信号强度呈现出持续的荧光恢复，在ClO -浓度为5 μM、10 μM和15 μM时，NIR-II信号强度分别增强到1.08倍、1.57倍和1.90倍。可以分辨低至5 μM的ClO -，差异显著。然后，为了模拟细胞内炎症，用LPS预处理HUVEC 4小时。在ANBSHQ-6传感器孵育2小时后，观察到激活的NIR-II信号比PBS组增强了约2倍，说明了SHINE策略可视化内源性ClO -的有效性。此外，n -乙酰- l-半胱氨酸(NAC)作为ROS清除剂预处理后，活HUVEC的NIR-II荧光信号与PBS组相比变化可以忽略不计。这些结果清楚地表明，ANB-SHQ-6传感器可以通过SHINE策略有效地实时可视化外源性和内源性产生的ClO -，为准确的体内癫痫可视化提供了先决条件。
癫痫模型中的响应研究
癫痫是最常见的神经紊乱疾病之一，影响全球6500多万人，因此，病变部位的实时可视化对癫痫的诊断具有重要意义。通过海马内注射kainic acid (KA)建立急性癫痫小鼠模型，导致髓过氧化物酶(MPO)表达上调，介导ClO的产生。为了使传感器具有血脑屏障(BBB)的渗透性，我们将angiopep2肽与ANB-SHQ-6传感器连接，形成ANB-SHQ-6pep传感器，其水动力直径为181 nm。静脉注射ANBSHQ-6-pep传感器后，在InGaAs相机下，小鼠患侧脑在8 h内明显变亮，信号增强为正常侧的3.4倍。在随后的12 h内，病变侧信号强度逐渐升高，并保持了正常侧3.2倍的增长，说明ka处理部位ClO持续产生。对小鼠实施安乐死，分离海马。患处海马的NIR-II信号增强3.2倍，表明增强的信号正是来自颅骨下的患处海马和高光子散射脑组织。为了进一步评估神经元的损伤情况，健康和ka处理的小鼠脑切片的尼氏染色。海马齿状回(DG)、CA1、CA3亚区神经元密度明显降低。特别是在CA1亚区，由于靠近KA注射部位，神经元数量急剧减少4倍。这些结果与实时NIR-II成像可视化结果高度一致，验证了利用SHQ构建的SHINE传感器监测活癫痫小鼠ClO形成过程的能力。
总结
通过调节荧光团的分子堆积状态，建立了一种新的荧光传感机制。由于ANB和SHQs之间没有光谱重叠，当SHQ与ANB骨架竞争包装时，ANB的NIR-II荧光信号被成功抑制，从而阻止了ANB及其NIR-II AIE信号的自聚集。然后，赋予SHQ响应性，进一步构建一个“off-on”SHINE传感器，用于活体小鼠海马癫痫的体内可视化。我们相信这种策略为调整荧光团的荧光强度和构建可激活传感器提供了一种新的选择。在这项工作中，我们使用了众所周知的AIE系统来证明我们的分子包装状态调节的概念。此外，其他聚集体系，如具有有序分子堆积状态(包括阶梯状、阶梯状和块状堆积状态)的H-/ j聚集体和基于AIE的聚合物也有可能被调整为具有荧光信号改变能力。同时，除了ClO-响应的引起的位阻效应损失外，更多具有响应性的分子可以被设计成空间位阻变化，有减小的也有增大的。最后，我们还可以研究分子填充调节后的吸光度和荧光寿命变化等光学性质。我们希望通过分子包装状态调控为可激活传感器的设计开辟一条新的途径，拓宽传感领域。
参考文献
NIR-II Fluorescence Sensor Based on Steric Hindrance Regulated Molecular Packing for In Vivo Epilepsy Visualization ，Mengyao Zhao, Weiping Lai, Benhao Li,Tianwen Bai, Chunyan Liu,Yanfei LinShixuan An, Longhua Guo,Lei Li, Jianbo Wang,* and Fan Zhang*， Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202403968 https://doi.org/10.1002/anie.202403968
