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内容提要

   具有高精度时空控制的光活化分子极大地促进了荧光染料的生物成像和光治疗应用。本文描述了第一个可光激活传感器(BI)，经历系统穿越和氢原子转移过程形成超氧阴离子自由基(O₂^−•)和碳自由基。碳中心自由基(BI•)经过自由基-自由基耦合提供组合交联产物(BI─BI)，该交联产物将在O₂^−•存在下被氧化，从而产生具有近红外发射的荧光。光化学生成的产物(Cy─BI)具有高达90.9%的超高光热转换效率。Western Blot结果显示，BI和光产物Cy─BI均能有效抑制CHK1的表达，诱导细胞凋亡，增强光疗效果。细胞周期阻滞诱导凋亡、光动力学治疗和光热治疗联合使用可显著抑制实体瘤的体内抗肿瘤疗效探索。

实验结果与结论

BI的体外光物理性质

   首先研究了BI染料在可见光照射下可能发生的光化学反应。BI在450 ~ 650 nm处有较宽的吸收峰。将混合物(BI in H₂O)在室温下暴露于白光发光二极管(LED)光(110 mW cm^-2)下60分钟后，在800 nm处新的吸收带逐渐增强，在730 nm处出现的肩峰对应于典型的H-聚集体态。Cy─BI在H2O中的蓝移吸光度峰证明了H -聚集体的行为。研究了BI和Cy─BI在不同溶液和pH = 6.0的酸条件下的荧光和紫外可见光谱。此外，在LED灯照射过程中，我们还观察到在820 nm处荧光发射的光转化产物Cy─BI。接下来，我们研究了不同激发波长下BI的光转换行为。在不同波长(405、532、580和637 nm)的光照射下，BI获得了相似的荧光和紫外可见光谱，证实了在广谱光照射下发生的Cy─BI转化。

BI的光转换机理

   我们详细研究了光激发下BI转化为Cy─BI的化学途径。高效液相色谱(HPLC) -质谱(MS)和电子顺磁共振(EPR)研究表明，通过一系列键裂解和重构过程，形成了新的C = C。含有捕获碳中心自由基的5,5-二甲基-1-吡咯啉n-氧化物(DMPO)与BI的混合物暴露于光照射后，在3475-3550 G中出现了几个DMPO -碳自由基加合物对应的信号峰，这解释了O₂^−•的生成。用高效液相色谱法测定了BI的光活化产物。在m/z 267.18546处，保留次数为5.84的峰对应于BI。在光照射1 min后，我们可以发现正离子质谱在m/z 267.18555处出现一个峰，保留时间为6.08，与BI标准相对应;在高分辨率质谱(HRMS)光谱中观察到正离子质谱中m/z 266.17780处的信号，相对保留时间为5.81 min，与BI─BI相对应。在LED灯照射30 min后，在m/z 265.16968处观察到一个信号，其停留时间为4.95，充分证明了在有光的情况下可以产生Cy─BI。我们可以合理推测，在光激发下，BI分子通过H原子转移(HAT)进行均裂键形成碳中心自由基，并伴随O₂^−•的生成进行电子转移过程，然后瞬态碳自由基的快速自由基-自由基耦合提供所需的BI─BI，最终被O₂^−•氧化生成具有扩展共轭体系的Cy─BI。

   为了进一步确定Cy─BI是否是O₂^−•与BI─BI反应的产物，我们测试了在抗氧化剂存在下的光转化过程。紫外可见和荧光分析的光转化证实了这一假设，抗坏血酸钠(ASC)的引入抑制了Cy─BI的产生。O₂^−•的存在加速了Cy─BI的生成。然后，用二氢膦胺6G (DHR 6G)作为O₂^−•的指标来测定受激BI产生ROS的能力。在光照下添加BI后，DHR 6G在570 nm左右的荧光明显增强，而在光照下(637 nm)，无论是否添加BI, DHR 6G本身的荧光变化都可以忽略不计。这表明O₂^−•是通过激发三重态BI*生成的，在Cy─BI的光转化中起着至关重要的作用。光活化BI可用于生物系统中O₂^−•分布的跟踪和成像。接下来，评价了生成的碳中心自由基对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的光氧化作用。含有NADH的溶液在BI•存在下光照射后，339 nm处属于NADH的吸收峰减弱，260 nm处对应于NAD+的吸收峰增强。结果表明，NADH可被BI•氧化。

Cy─BI的光热效率

   为了验证光控疗法的通用性策略，我们进一步评估了808 nm (600 mW cm^-2)激光照射下Cy─BI和BI在水中的光热效应。Cy─BI溶液(0.5 mL, 20 μm)的温度显著升高，在240 s内达到82.7℃的高温。然而，在相同条件下，BI和不含Cy─BI的纯水的温度变化可以忽略不计。根据光热效应和时间常数计算Cy─BI的PCE为90.9%，远高于以往报道。这种较高的PCE可能归因于共轭刚性平面分子结构和h聚集。此外，我们可以发现，Cy─BI即使经过5次激光照射，也表现出优异的热稳定性和光热转换性能。此外，光热效应与Cy─BI浓度、激光功率和照射时间呈正相关，表明光热效应可以得到很好的光控。

BI和Cy─BI通过抑制CHK1诱导细胞凋亡

   首先，用HeLa细胞研究了BI在光照射下的光转化过程。经BI预处理的HeLa细胞(白光，50 mW cm^-2)辐照可诱导近红外荧光显著增强，这归因于Cy─BI的形成)。然后用ROS探针DHR 6G检测光照射下细胞ROS的变化。光照射后，BI预处理的细胞出现亮绿色荧光，表明ROS生成有效。此外，我们可以发现，脂多糖(LPS)-、四氯化碳(CCl4)-和硫酸铵预处理的细胞即使没有光处理，也能明显增强近红外荧光。然而，当n -乙酰半胱氨酸(NAC)-、ASC-或二甲双胍(MET)处理的HeLa细胞进一步暴露在光下时，几乎没有检测到荧光信号。这些发现支持了Cy─BI是在光照射和细胞ROS上调的情况下在HeLa细胞中产生的。

   为了探讨BI对光照射的影响，我们对HeLa细胞进行了Western Blot检测。Western Blot检测显示，BI和Cy─BI均能显著降低CHK1的表达。重要的是，我们可以发现BI照射可以更有效地抑制CHK1的表达。这可能是因为在激光照射(660 nm, 100 mW cm^-2)的条件下，BI会与周围的O₂敏化生成O₂^−•，生成的O₂^−•可以显著增强对CHK1表达的抑制作用。同时，我们还发现，激光治疗的BI导致CHK1 - S296磷酸化显著增加，这表明BI通过近红外照射产生了O₂^−•活化的CHK1。对于Cy─BI，光照射处理也显示CHK1磷酸化显著增加，这可能与Cy─BI在808 nm照射下的光热效应有关。这些数据表明BI和复杂的Cy─BI激活了涉及CHK1的S期检查点。先前的研究表明，CHK1磷酸化增加了其周转量，从而降低了CHK1总蛋白水平。我们发现在光照射下，BI和复合物Cy─BI存在时，总CHK1蛋白水平降低。特别是，探针BI和配合物Cy─BI的照射都能明显增强cleaved - caspase-3，增强因子分别为3.2倍和4.6倍。上述结果表明，探针BI和复合物Cy─BI在激光照射下均通过阻滞细胞周期S期诱导细胞凋亡。因此，探针BI可以被认为是治疗癌症的一种治疗策略。为了证实光诱导O₂^−•生成通过抑制CHK1而大大促进探针BI诱导的细胞凋亡，我们进一步研究了在660 nm激光下NAC处理是否影响探针BI诱导的细胞凋亡。我们发现NAC预处理后CHK1的表达明显增加，并抑制caspase-3的活化，而对探针BI诱导的CHK1磷酸化无显著影响。激光660 nm处理的探针BI导致裂解caspase-3的激活在pm2.5暴露后明显增加。因此，探针BI可能作为PDT剂对肿瘤细胞有很好的作用。

BI的体内成像

   在测试BI在体内应用于体内近红外成像之前, 我们首先探索了光转换行为。激发波长为745 nm，采集波长为820 nm，曝光时间为10 s。将BI溶解于水中进行实时荧光成像，成像过程中观察到较强的近红外荧光增强(约2.1倍)，证实了BI在成像过程中具有较高的光活化性能。因此，在后续成像过程中，直接将BI注射到小鼠体内，除BI介导的PDT和PTT外，不进行激光照射进行体内成像。然后，为了确认BI作为一种智能光转换剂在体内的应用潜力，我们检测了活小鼠的光控转换事件。随着640 nm激光照射时间的延长，小鼠左侧皮下注射BI可观察到明显的荧光强度，而右侧注射BI的区域未经过激光照射时荧光信号相对较弱。在进一步的实验中，小鼠通过尾静脉静脉注射BI。30分钟后，我们取下肝脏，然后用准备好的箔片覆盖肝脏，并留下一个孔供激光照射。可以看出，与锡纸覆盖的区域相比，激光照射的区域显示出明显的近红外荧光。

   通过尾静脉注射BI对BALB/c裸鼠进行体内近红外荧光成像。BI注射20 min后，小鼠脑内可见明显的荧光，近红外荧光强度在24 h时达到最大值，证实了BI具有较高的血脑屏障(BBB)通透性，以及BI与存在的O₂或特异性生成的O₂^−•具有良好的光转化能力。为了进一步评估BI的光控转换和O₂^−•成像能力，我们建立了一个癫痫小鼠模型，该模型已被证明涉及显著高水平的O₂^−•。经尾静脉给小鼠注射BI (400 μm, 50 μL)后，小鼠脑内荧光信号强度在10 min内显著增加，20 min后检测到的荧光信号增加约22%。这些结果表明，光激活的BI分子有望在体内快速有效地渗透血脑屏障，实现神经和精神疾病中O₂^−•的原位成像。

   我们探讨了BI在不同药物引起的器官疾病发作期间或之后对O₂^−•的空间成像能力。心脏作为循环氧气和血液的泵，在全身循环，24小时后，BI处理的小鼠(对照组)在小鼠心脏中出现了积累的荧光信号。然后，腹腔注射剂量为(20 mg kg - 1)的LPS，用于体内氧化应激诱导的O₂^−•纵向跟踪。腹腔注射BI后lps处理小鼠的肝、脾、肾荧光信号明显高于阴性对照组。此外，注射CCl4小鼠的肝脏和肾脏中观察到强烈的荧光信号，这可能是由于CCl4诱导O₂^−•过量产生导致肝脏和肾脏明显损伤。相比之下，MET处理小鼠的心脏、肝脏、肾脏等不同器官的荧光信号水平下降，这可能是由于MET减少了过量的O₂^−•的产生。总的来说，由于BI具有独特的组合和成像O₂^−•的能力，转化后的Cy─BI具有近红外荧光信号，使我们能够以高度空间可控的方式观察O₂^−•的生物分布。

   我们用Hela细胞和雌性Hela荷瘤BALB/c裸鼠模型进行了一系列实验，旨在证明激光照射下BI和Cy─BI的光控PDT和PTT。在黑暗中，BI对处理过的HeLa细胞表现出相对较低的细胞毒性。然而，在细胞暴露于白光照射(30分钟)后，观察到良好的光毒性，证实了光控PDT治疗的有效性。此外，在Cy─BI(0、1、2.5、5、10 μm、808 nm、300 mW cm^-2)或Cy─BI (10 μm)以808 nm、100、200和300 mW cm^-2的激光照射5 min后，由于Cy─BI的高PCE，细胞活力显著降低。然后将HeLa荷瘤裸鼠随机分为BI组(对照组)和BI +激光组(实验组)进行体内成像。原位注射BI和激光照射治疗后，连续制作HeLa荷瘤裸鼠体内荧光图像6天。BI组小鼠在660 nm激光照射下(15 min)，从10 min到24 h荧光快速增强，且肿瘤处荧光强度明显增强，在注射后24 h达到最大，6 d内荧光强度略有下降。肿瘤区域出现的近红外荧光增强可能归因于激活的光转化和H聚集体，从而延长了肿瘤保留时间。此外，我们可以发现，在激光(660 nm, 50 mW cm^-2,10 min)下注射BI组小鼠的荧光增强比BI组更快，更高。在激光治疗组中获得的更强的近红外信号清楚地证明了BI潜在的I型PDT疗效，这与上面讨论的水介质中的结果一致。

   受到对肿瘤反应的光激活辐射的启发，我们在进一步的实验中进行了Cy─BI从正常组织中识别肿瘤组织的能力。治疗24 h后，激光照射组处死1只小鼠，第一道手术后切除肿瘤。由于肿瘤组织中O₂^−•过表达，肿瘤组织与正常组织的比值高达9.8，从而可以准确地识别肿瘤组织。在近红外荧光成像的指导下，我们可以识别并去除正常组织的小块。因此，我们推测BI可能在临床领域作为一种强大的对比工具来辅助精确的肿瘤切除。随后，进一步构建HeLa荷瘤小鼠模型，评估Cy─BI在体内的PTT效率。体内光热图像显示，在激光808 nm, 100 mW cm^-2照射2 min时，对照组(生理盐水)温度升高约1.6°C。相反，在100 mW cm^-2照射下，注射Cy─BI的肿瘤温度在2 min内从36.7°C迅速上升到48°C，表明在较低激光功率下Cy─BI在体内具有出色的PTT疗效。

   作为概念性证明，我们在四组HeLa肿瘤小鼠身上研究了PTT-PDT的体内协同作用。1：对照组(注射生理盐水); 2：注射BI; 3：注射BI，然后激光照射(660 nm); 4：注射BI，然后激光照射(660 nm, 808 nm)。采用660 nm激光进行PDT治疗10 min, BI注射后24 h, 660 nm激光照射10 min, 808 nm激光照射5 min，评价PTT疗效。在12天的时间里，通过监测肿瘤的平均大小来评估各组的治疗效果。在包括BI在内的实验组中，BI +激光(660 nm，仅PDT)、BI +激光(660 + 808 nm, PDT和PTT)治疗均能成功抑制肿瘤生长，而对照组注射生理盐水后肿瘤体积平均增加约6倍。令人惊讶的是，与对照组(注射生理盐水)相比，BI治疗组小鼠的肿瘤生长速度显著降低，这是由于CHK1和细胞凋亡受到抑制。我们可以发现BI +激光(660 + 808 nm)组具有突出的抗肿瘤作用。此外，四组小鼠的体重变化可以忽略不计，这表明PDT和PTT治疗不会对小鼠产生副作用。综上所述，我们认为这些发现清楚地揭示了不同激光触发的PDT和PTT照射对BI具有优异的光控治疗性能，对指导合作治疗的发展具有重要的指导意义。

结论

   我们提出了一个自由基参与的二聚体机制来解释共轭主链的形成。光激发BI分子具有较高的ISC效率和HAT过程，从而通过三重态和H转移过程高效生成碳中心自由基和O₂^−•。重要的是，光能转化的Cy─BI具有强大的近红外吸收强度和近红外荧光，能够以高空间和时间分辨率清晰地显示复杂的O₂^−•相关生物过程。此外，与常见的i型有机光敏剂依赖O₂产生ROS不同，BI被证明是一种强大的自由基来源，因此在未来的临床治疗中可能会克服缺氧不敏感的障碍。不仅如此，光激活产物Cy─BI在肿瘤小鼠模型中表现出优异的PCE, PTT效率高达90.9%。Western Blot结果显示，BI及其光激活产物Cy─BI对CHK1均有明显的抑制作用，从而导致细胞周期阻滞在S期和G2/M期，最终导致细胞凋亡死亡。PDT、PTT和凋亡途径的联合作用增强了肿瘤抑制的协同作用。我们预计，本文所描述的以前未报道的有前途的方法将为发展光控生物成像和治疗提供有价值的途径。

参考文献

Photoactivation Inducing Multifunctional Coupling of Fluorophore for Efficient Tumor Therapy In Situ，Weijie Zhang, Yunxia Lv, Fangjun Huo, Yang Yun, Caixia Yin，Adv. Mater. 2024, 2314021，https://doi.org/10.1002/adma.202314021.