内容提要
动脉粥样硬化(AS)是血管斑块的形成，导致严重的心血管疾病。目前的研究表明，AS斑块的形成与巨噬细胞的发泡密切相关。我们提出了一种“活体传感器”，通过代谢和生物正交标记将比度NO探针嫁接到巨噬细胞中。在AS小鼠模型中，这种“实时传感器”可以特异性靶向直径仅为几十微米的AS斑块，并在两个病变阶段显示内源性NO。来自探针的比率信号证实了NO在AS过程中的参与，并表明内源性NO的产生随着病变的进展而显著增加。我们提出的这种“实时传感器”提供了一种天然和智能的策略，可以在体内水平上靶向并传递小分子探针到AS斑块，这可以作为检测AS反应性分子或微环境因素的通用平台。
实验结果与讨论
NO探针的设计
我们首先设计并合成了基于Förster共振能量转移(FRET)的比例NO探针BOD- Tz -TMR，该探针由三部分组成:稳定的BODIPY供体(命名为BOD)， NO敏感的罗丹明受体(命名为TMR)和四嗪连接体。根据我们之前在FRET探针构建方面的工作，选择BODIPY和罗丹明作为完美的组合。在本设计中，我们选择四嗪作为优化的功能连接剂，分别通过酰胺缩合和“点击”反应连接BODIPY供体和TMR受体，并通过温和的生物正交反应留下一个四嗪将FRET对标记在活细胞上。这种灵活的连接使得四嗪可以有效地淬灭两个荧光团的荧光，而不影响荧光共振能量转移(FRET)效率，这有利于限制非键合探针的背景信号。
探针BOD-TZ-TMR对Ac4ManN-BCN和NO的光谱响应
该实时传感器包括三个部分的设计：NO探针的设计、Ac4ManN-BCN对RAW 264.7细胞的糖代谢工程、NO探针对RAW 264.7细胞的标记。我们通过糖代谢和生物正交标记制作了实时传感器。巨噬细胞在这一过程中起着主要作用，因此我们选择巨噬细胞作为我们策略的“活”部分。这些RAW 264.7细胞预计将携带BOD-Tz-TMR到斑块的位置。因此，我们首先用自己设计的连接体Ac4ManN-BCN对RAW 264.7细胞进行了工程改造，预计该连接体将通过糖代谢融合到活的RAW 264.7细胞的膜结构中。Ac4ManN衍生物倾向于通过糖代谢来丰富所有细胞器的膜结构然而，由于线粒体、内质网等不同细胞器的膜结构叠加，再加上共聚焦显微镜的分辨率限制，荧光图像无法清晰显示膜结构的形状。将Ac4ManN-BCN孵育RAW 264.7细胞系24小时，再用用5 μM BOD-Tz-TMR标记工程RAW 264.7细胞2小时。在此过程中，四嗪基团与RAW 264.7细胞中的BCN发生反应，导致探针在细胞内固定，产生活传感器。生物正交标记后，打开供体的绿色荧光，将受体罗丹明置于待机状态，检测NO。我们首先测定了工作浓度(20 mM)下Ac4ManN-BCN对RAW 264.7的影响。20 μM Ac4ManN-BCN孵育48小时后，高达95%的细胞存活。接下来，我们评估了探针对RAW264.7的生物正交标记的影响。浓度为6 μM的BOD-Tz-TMR孵育48 h后，92%的细胞存活。
通过在溶液中进行了光谱研究，以评估四氮基团的荧光猝灭效果、BOD-TZ-TM对NO检测的灵敏度、探针内的FRET过程以及免洗涤效果。我们验证了探针BOD-TZ-TMR可以与BCN和NO反应，分别进行生物正交标记和NO检测。在第一次实验中，我们在PBS中加入100 μM BCN(20倍)至5 μM BOD-TZ-TMR。发射强度在512 nm处达到峰值(来自BOD部分)，并在5 min内从81.7 au增加到689.7 au(8.4倍)，说明四嗪基团与BCN反应迅速，有效地恢复了BOD部分的荧光。此时，发射强度在592 nm处达到峰值(来自TMR部分)，由于TMR部分仍处于非荧光螺内酰胺形式，因此发射强度保持在较低水平。然后我们在上述溶液中加入过量的NO。发射强度在592 nm处达到峰值(来自TMR部分)，30 s内从1.8 au增加到221.6 au(123倍)，而BOD部分的发射强度从689.7 au下降到180.7 au，这表明TMR部分与NO反应恢复了其荧光能力，开启了从BOD到TMR部分的FRET过程。该实验证明四氮组和Rh部分分别起良好的作用。
其次，我们研究了四氮基团对两个荧光团的猝灭作用。在本实验中，我们将过量的NO添加到PBS中的5 μM BOD-TZ-TMR中。592 nm处(来自TMR部分)的发射强度峰在30 s内从1.9 au略微上升到22 au，而来自BOD部分的发射强度从81.7 au下降到25.5 au，这表明TMR部分与NO发生反应，开启了从BOD到Rh部分的FRET过程。然而，BOD (25.5 au)和TMR (22 au)部分的强度都远低于BCN和NO反应后的强度(BOD: 180.7 au, TMR: 221.6 au)。结果表明，四氮基团猝灭了两个荧光团的荧光，表明自由电位探针的背景信号较弱。这些结果表明，四氮基团可以有效地淬灭探针BOD-TZ-TMR的荧光，并且经过生物正交反应后，两个荧光团的荧光能力都可以大大恢复。此外，即使经过生物正交反应，探针仍能对NO产生良好的反应，这表明探针具有降低背景噪声和实现免水洗效果的潜力。
细胞中外源性和内源性NO的检测
生物正交技术在温和条件下具有高特异性和高效率，因此对活细胞的干扰最小。它通常涉及将反应性基团引入目标生物系统，并通过高选择性生物正交反应将探针/跟踪器标记到上述基团上。Ac4ManN-BCN通过生物合成机制-代谢方法锚定在活的HeLa细胞中。BCN群分布在细胞的所有膜结构上，并作为人工靶。然后用BOD-TZ-TMR处理细胞，通过BCN组和四嗪组的反应完成生物正交标记。生物正交标记过程打开BOD的荧光并产生最终的活传感器。为了确认标记的稳定性，我们用多聚甲醛固定细胞，然后进行荧光成像。我们从活传感器和固定活传感器的BOD部分观察到同样强烈的绿色荧光。对于相对较大分子量的分子，需要两步生物正交标记过程才能得到稳定和正确的结果。在对照实验中，使用探针BOD-TZ-TMR(预先与Ac4ManN-BCN反应)对HeLa细胞进行24小时的一步染色。我们确实在细胞中观察到强烈的荧光，这似乎表明染色成功。然而，我们随后用多聚甲醛固定这些细胞。我们从BOD部分观察到更弱的荧光，这表明探针未能锚定到细胞上。与此相反，我们也固定了两步染色的细胞并用PBS洗涤三次。令人惊讶的是，用两步法染色的细胞仍然保持强烈的荧光。这些结果证明两步标记策略的必要性，特别是对于具有较大结构的分子。
我们使用HeLa和RAW 264.7细胞系制备了两个实时传感器。我们首先使用HeLa细胞衍生的活传感器检测外源性NO。我们在活体传感器中加入NO水溶液，然后用共聚焦显微镜收集荧光图像。在NO加入之前，BOD通道显示出较强的荧光，而TMR通道几乎没有荧光。添加NO后，TMR通道的荧光强度显著增加，BOD通道的荧光强度显著降低。平均荧光强度也可以反映添加NO前后两个通道的荧光变化。添加NO后，TMR与BOD通道的比值从0.032±0.008增加到1.107±0.045。如上所述，巨噬细胞在As斑块的形成中起重要作用。它们是将NO探针递送到AS斑块的理想载体，也是内源性NO的产生者。因此，我们使用RAW264.7细胞衍生的活传感器检测内源性NO。用脂多糖(LPS)、l -精氨酸(L-Arg)和干扰素-γ (IFN-γ)或金黄色葡萄球菌(S. aureus)刺激该活传感器24小时，模拟炎症状态，然后使用共聚焦显微镜成像。与未处理的活体传感器相比，观察到TMR通道的强烈荧光;同时，与未处理的活体传感器相比，绿色通道的荧光明显下降。相应地，TMR和BOD通道的比值从0.034±0.006增加到1.055±0.049。我们还使用金黄色葡萄球菌刺激进行了炎症过程，并观察到荧光与上述化学刺激相似的反应。值得注意的是，BOD-TZ-TMR分布在整个细胞中以有效捕获NO。这些结果证实了这些传感器检测NO的稳定性和灵敏度。
NO的体外监测
我们首先通过用ox-LDL刺激RAW 264.7细胞来检测泡沫细胞形成过程中NO的产生。，ox-LDL刺激24 h后，红色通道荧光明显增强，提示检测到NO。相比之下，对照组在没有ox-LDL刺激的情况下，红色通道的荧光可以忽略不计。相应地，刺激后的比值也从0.045±0.015显著增加到1.02±0.064。我们还比较了刺激前后细胞的形态学特征。ox-LDL刺激后，在明亮视野中可以观察到清晰的泡沫样溶酶体形成，但在对照组中未观察到泡沫样细胞，这与先前文献报道一致这些结果证实探针BOD-TZ-TMR能够检测AS泡沫细胞形成过程中的内源性NO。
NO在AS小鼠模型中形成的监测
最后，我们利用这种实时传感器在小鼠模型中检测动脉粥样硬化斑块形成过程中NO的产生。载脂蛋白e缺乏(ApoE−/−)小鼠是as的典型模型，因为在8 - 12周的高脂肪饮食后，它们的动脉壁出现了动脉粥样硬化病变。随着时间的推移，这些泡沫细胞积累，经历坏死，并产生斑块。这个过程也会引发炎症反应并吸引额外的RAW 264.7细胞。在这里，我们设置了三组:对照组(健康小鼠)、2个月ApoE−/−小鼠(早期AS)和3个月ApoE−/−小鼠(晚期AS)。活体传感器分别静脉注射给实验组和对照组小鼠。36 h后，解剖小鼠，取主动脉，在体内成像系统和共聚焦显微镜上成像。我们首先通过双色成像模式收集主动脉的离体图像(绿色通道为供体BOD: 500 - 550 nm，红色通道为受体:570 - 620 nm)。如图绿色通道图4B所示，从活体传感器的靶向能力来看，两个实验组沿主动脉均出现了密集的荧光聚集位点，即斑块位点。而在对照组的绿色通道中，只有微弱的荧光沿着主动脉扩散，这是因为对照组小鼠中没有斑块。以上对比证明了该实时传感器对AS斑块的靶向准确性。进一步，在NO检测方面，我们观察到两个实验组的红色通道荧光强烈，表明AS在发展过程中产生了过量的NO。我们的实时传感器捕获这些一氧化氮并存储这些RNS用于离体成像。据我们所知，这是第一次在AS形成过程中直接检测到内源性NO。相比之下，对照组的红色通道几乎没有荧光。为了进一步证实斑块的大小和位置，我们对对照组和两个实验组的主动脉进行了组织学切片，并对这些切片进行了共聚焦荧光成像。这些切片首先用尼罗河红(一种用于AS斑块的商业染料)染色以突出斑块，然后用于成像。从斑块靶向和活体传感器NO检测两方面显示和分析标记(白色箭头)位点的荧光图像。我们在绿色和红色通道中都观察到强烈的荧光信号，并且它们与尼罗河红有很好的重叠，这进一步证明了我们的实时传感器的靶向准确性。对照组仅观察到尼罗河红的微弱荧光，表明健康小鼠没有斑块。此外，我们的实时传感器还绘制了斑块横截面的形状。As早期斑块的横截面尺寸较小，边缘光滑，而As晚期斑块的横截面尺寸较大，边缘不规则(可能即将破裂)。在形状特征之后，我们还观察到两个实验组的荧光比(R/G)的差异。两个实验组的荧光比(R/G)远高于对照组(0.047±0.009)，且3个月组的荧光比(0.73±0.06)略高于2个月组(0.63±0.04)。这一结果表明更多的NO参与了AS的晚期。最后，我们在3个月组中对一个代表性动脉的不同大小的斑块进行了解剖和成像。用白色箭头标记，我们发现红色通道的强度和两通道的比值与斑块的大小呈正相关，表明斑块后期产生了更多的NO。这些结果表明，实时传感器可以通过定量检测内源性NO来发现斑块并识别AS斑块的阶段。
结论
我们展示了一种实时传感器，它可以作为血管中的“精英巡洋舰”，发现AS斑块并检测斑块内的内源性NO。该传感器采用四氮桥接FRET系统设计比例NO探针(BOD-TZ-TMR)，用四氮修饰的糖基化合物(Ac4ManNBCN)对RAW 264.7细胞进行天然代谢工程，并用高效的四氮- BCN生物正交点击反应对活细胞进行温和标记。BOD-TZ-TMR探针对体外NO具有高灵敏度、高选择性和快速反应率。此外，装有该探针的巡弋细胞即RAW 264.7细胞，在静脉注射到血管系统后，通过离体荧光成像自动准确地发现小鼠AS模型中的AS斑块。进一步，他们可以在两个AS阶段捕获和可视化斑块中的内源性NO。比值信号显示NO的生成与AS斑块的分期呈正相关，即同一动脉中较大斑块的内源性NO浓度远高于较小斑块。这些结果表明NO参与了AS的形成过程，特别是在晚期。我们提出的这些实时传感器提供了一种天然和智能的策略，可以在体内水平上靶向并传递小分子探针到AS斑块，这可以作为检测AS反应性分子或微环境因素的通用平台。
参考文献
Tetrazine-Based Ratiometric Nitric Oxide Sensor Identifies Endogenous Nitric Oxide in Atherosclerosis Plaques by Riding Macrophages as a Smart Vehicle,Lin Zhou, Zehui， Wang, Lai Wang, XinfuZhang*, and YiXiao, J.Am.Chem.Soc. 2023,145,51,28296–28306, https://doi.org/10.1021/jacs.3c12181.
