内容提要
酶激活近红外(NIR)荧光探针和光敏剂(PS)已成为分子成像和光动力治疗(PDT)的有前途的工具。然而，在生物体中，酶激活后在感兴趣的位点或附近选择性保留甚至富集这些试剂仍然是一项具有挑战性的任务。我们整合了非共价和共价保留方法，引入了一种新的多效应策略, 一种酶刺激导致三种类型的效应, 用于设计酶激活的近红外探针或PS。利用这种策略，我们构建了一个碱性磷酸酶(ALP)激活的近红外荧光探针和一个近红外PS，它们分别被ALP选择性激活以开启近红外荧光或光敏能力。这些试剂在ALP过表达的肿瘤细胞中显示出显著的富集，伴随着细胞内硫醇的大量消耗。在体内PDT模型中对这种可激活NIR PS的研究结果表明，HeLa肿瘤完全被抑制，所有被试小鼠完全康复。即使单次使用这种NIR PS也足以完全抑制小鼠的肿瘤，这表明该策略在生物医学应用中的巨大应用前景。
实验结果与讨论
ALPIN-6和ALPIN-6I的设计合成
用于活体动物的荧光团或PS的一个重要先决条件是它们的激发/发射落在近红外范围内(650-1700 nm)。这有助于减少来自组织自身荧光的干扰，并允许相对较深的组织穿透。目前，这些有机近红外荧光团或ps大多具有疏水核心结构。为了在体内研究中使用这些亲水性分子，特别是当需要静脉给药时，需要额外的亲水性基团。然而，在近红外荧光团或PS中引入亲水性基团通常会导致低细胞渗透性和目标位点的保留效率。理想的酶激活成像试剂或PS应该具有可切换的亲水性。它最初应该是亲水的，以便通过静脉给药自由递送到靶组织，并从非靶组织中快速清除。然而，在与目标酶相互作用时，它应该在感兴趣的位点变成疏水性，以增强细胞渗透性和保留效率。考虑到这一点，我们设计了一种新颖的“1到3”多效策略来构建酶激活的近红外荧光探针或PS。该探针或PS由四个主要成分组成:酶响应单元、近红外荧光团或PS、离去基和连接离去基的亲水单元。近红外荧光团或PS是疏水性的。然而，可切割亲水单元的存在确保了酶激活试剂的高水溶性，从而允许通过静脉给药自由递送到目标组织，并从非目标组织中快速清除。当暴露于特定的酶时，该试剂通过去除离开基和亲水单元，从水溶性和荧光或光敏非活性状态转变为不水溶性，细胞渗透性和活性的QM中间体，这大大减少了从感兴趣位点的扩散。然后通过亲核加成反应将活性QMs共价固定在靶酶、附近蛋白质或其他细胞内亲核试剂上，从而在靶细胞中显著富集。同时，近红外荧光信号或光敏能力被激活。ALPIN-6或ALPIN-6I的亲水单位附着在离去基团上;锚定在癌细胞外膜上的ALP通过释放亲水性两性离子和磷酸盐，将亲水性ALPIN-6或ALPIN-6I转化为高度疏水性和细胞渗透性的QM中间体。这些活性QMs与细胞外膜上ALP或附近蛋白质的亲核残基反应，或进入细胞并与细胞内的亲核试剂(主要是硫醇)反应。这导致荧光或光敏能力的开启，这些活化分子在靶细胞中富集。在细胞中富集这些QMs可能会消耗游离硫醇，包括谷胱甘肽(GSH)，一种主要的抗氧化剂，从而进一步增强酶激活PS对PDT的疗效。
ALPIN-6光物理性质研究
利用ALPIN-6探针，我们首先记录了其在PBS (pH 7.4)中与ALP孵育前后的紫外/可见吸收和荧光光谱。从图可以看出，经过ALP处理后，该试剂的吸收由657 nm逐渐红移至687nm, 714 nm处的荧光增强，说明ALPIN-6可以被ALP水解。与游离ALPIN-4相比，ALPIN-6的吸收和最大荧光强度都较低。这可能是由于缺乏强亲核试剂。在ALP培养的ALPIN-6中加入亲核性β-巯基乙醇(β-ME)，可以模拟生命系统中的亲核蛋白，从而增加其吸收和荧光强度。作为对照，在不添加ALP的情况下加入β-ME时，ALPIN-6的荧光强度没有变化，说明ALPIN-6对硫醇稳定。此外，对ALPincubated ALPIN-6溶液的HPLC分析表明，探针被完全水解，形成了在600 nm处吸收的混合物。这些混合物可能是由各种亲核试剂(包括水)对QM中间体的亲核加成而形成的。正如预期的那样，在ALP存在的情况下，亲核β-ME加入ALPIN-6，形成了一个新的主要产物，通过LC-MS鉴定为β-ME加合物。通过将探针与一系列重要的生物学分析物(包括溶菌酶、胰蛋白酶、脂肪酶、谷胱甘肽和牛血清白蛋白(BSA))孵育，还评估了ALPIN-6的选择性。这些分析物都没有引起明显的荧光增强。此外，ALP抑制剂Na3VO4的加入极大地抑制了ALP对近红外荧光的激活。基于这些结果，我们得出结论，ALPIN-6的激活是一个高度ALP特异性的过程。为了验证酶激活后ALPIN-6与目标酶或附近蛋白之间是否形成共价键，我们将该化合物与ALP孵育，然后使用凝胶内荧光成像对其进行分析。我们观察到与ALP孵育的ALPIN-6有明显的近红外荧光发射。在ALP孵育的ALPIN-6中添加非催化性BSA作为额外的蛋白质，导致BSA和ALP两种蛋白质都发出近红外荧光。同时，在没有ALP的情况下，ALPIN-6与BSA孵育，BSA条带上没有荧光，证实了ALPIN-6共价标记的特异性。我们观察到，在相同条件下，ALPin -6培养的ALP比ALPin -5处理的ALP荧光信号更强。由于这两种化合物是结构类似物，都可以被ALP激活形成具有相似反应活性的QM中间体，因此ALPIN-6具有较高的标记能力可能是由于其在酶激活时能够切换亲水性。由亲水性ALPIN-6形成的疏水性QM中间体有效地减缓了ALP的QM中间体的扩散，并减少了其他小分子亲核试剂(如水)对QM的亲核加成。
ALPIN-6细胞中荧光成像
用浓度为10 μM的ALPIN-6对ALP过表达的HeLa细胞(人宫颈癌细胞)进行初步实验。结果显示细胞发出极强的荧光。因此，我们将ALPIN-6的浓度降低到1 μM，即使在如此低的浓度下，我们仍然观察到HeLa细胞强烈的近红外发射。此外，用ALP抑制剂Na3VO4预处理的HeLa细胞或ALP阴性的HEK293细胞用ALPIN-6处理几乎没有产生任何近红外荧光。为了比较标记效率，用自固定探针ALPIN-5孵育HeLa细胞，留下无组荧光探针ALPIN-4。在相同的条件下，ALPIN-6在细胞上产生的荧光明显强于其他两种试剂，其顺序为ALPIN-6>ALPIN-5>ALPIN-4，尽管在无基团的情况下，ALPIN-4在溶液测试中表现出更强的荧光。ALPIN-6在暴露时间为100 ms时，即使暴露时间增加到3000 ms，在细胞上产生的荧光也比ALPIN-4和ALPIN-5强得多。当这些近红外探针在ALP过表达的肝癌细胞HepG2上测试时，得到了类似的结果:与ALPIN-4和ALPIN-5相比，ALPIN-6在细胞上产生更强的荧光信号。流式细胞术分析进一步证实了细胞上荧光强度的差异。流式细胞术分析发现，在HeLa细胞和HepG2细胞上，ALPIN-6产生的荧光信号比留下无基团的荧光ALPIN-4强两个数量级以上，尽管在溶液试验中ALPIN-4的荧光强度高于ALPIN-6。由于这三种试剂都具有相同的酶反应单元和荧光团，因此ALPIN-6在细胞中诱导的荧光明显强于其他两种试剂，可能是由于其在细胞中的富集程度较高。ALPIN-6的荧光特性和细胞富集特性使其成为活体细胞中酶活性无水洗实时成像的理想试剂。为了验证这一点，我们将ALPIN-6与HeLa细胞孵育，并在不洗掉任何游离荧光团的情况下监测细胞上的荧光，持续20分钟。使用低至100 nM的ALPIN-6，在HeLa细胞的膜上孵育仅半分钟就出现荧光，而ALP主要位于HeLa细胞的膜上。孵育3分钟后，HeLa细胞内观察到荧光，反映了QM中间体的内化和随后的细胞亲核添加。细胞上的荧光随时间增加，表明细胞内活化的荧光团富集。随机选择一个点，细胞上的荧光强度比周围环境强2000倍以上。这对于免洗成像来说尤其令人印象深刻。为了研究ALPIN-6的标记特异性，我们将该试剂与HeLa细胞和ALP阴性HEK293细胞的混合物孵育，在显微镜下不进行洗涤成像。我们只在ALP过表达的HeLa细胞中观察到强荧光，而HEK293细胞则没有荧光。为了更容易区分HeLa和HEK293细胞，我们选择了cpyfp编码的HEK293细胞进行研究，这些细胞发出黄色荧光。当ALPIN-6与这些细胞孵育时，结果相似:HeLa细胞只观察到近红外荧光，而HEK293细胞发出黄色荧光，近红外荧光通道上没有任何信号。
ALPIN-6活体成像研究
我们研究了使用ALPIN-6对活体小鼠的ALP活性进行无创成像。值得注意的是，ALPIN-6具有高水溶性，易于经尾静脉注射到HeLa荷瘤BALB/c裸鼠体内。注射后1小时，在肿瘤部位检测到较强的荧光信号。在较长时间内强度保持稳定，注射后36小时仍可在HeLa肿瘤区检测到明显的荧光信号。同时，在静脉注射ALPIN-6之前，通过瘤内注射ALP抑制剂Na3VO4预处理肿瘤，肿瘤的荧光信号明显减弱，表明在肿瘤部位观察到的荧光信号确实是ALP激活的结果。用荧光探针ALPIN-4对荷瘤小鼠进行检测。注射后1小时，肿瘤部位的近红外荧光明显降低，4小时后信号迅速下降到接近背景水平。定量数据显示，在注射后36小时，ALPin -6处理小鼠的肿瘤荧光强度比注射ALPin -4的小鼠高约5倍。此外，在注射后36小时，通过对死亡小鼠正常器官和HeLa肿瘤的离体成像，进一步证实了ALPIN-6和ALPIN-4诱导肿瘤的荧光强度差异。值得注意的是，ALPIN-6在小鼠中的生物分布与自固定探针ALPIN-5相当，红外荧光发射主要在肿瘤以及肝脏和肾脏中检测到，这些部位的ALP活性均升高。然而，ALPin -6处理的小鼠肿瘤的荧光明显强于ALPIN-5处理的小鼠。鉴于这两种试剂的高度结构相似性，这些结果表明，在体内研究中，这种“1-to-3”设计可以显著提高活化荧光团在活化位点的保留效率。
ALPIN-6I体外光动力学治疗研究
采用标准MTT法评价多效PS对细胞的抗肿瘤效果。ALPIN-6I孵育和660 nm照射后ALP阳性HeLa细胞的活力与ALPIN-6I和照射剂量密切相关:ALPIN-6I浓度越高或照射剂量越大，HeLa细胞活力越低。相比之下，ALPIN-4I杀死HeLa细胞的效率要低得多。我们测定了辐照10分钟后，ALPIN-6I对HeLa细胞的IC50为1.2 ±0.1 μM，而ALPIN-4I对HeLa细胞的IC50大于10 μM。ALPIN-6I或ALPIN-4I对ALP阴性HEK293细胞无显著影响，无论是否使用660 nm照射(IC50>20 μM)。使用Calcein-AM/PI试剂盒进行活/死细胞染色，进一步评估ALPIN-6I治疗肿瘤的有效性。经过ALPIN-6I处理并在660 nm照射的HeLa细胞在红色通道中出现荧光，而在绿色通道中没有荧光，表明这些ALP过表达的细胞被有效杀死。当用ALPIN-6I或单独照射时，HeLa细胞仍然存活，并且仅在绿色通道中发出荧光。ALPIN6处理和辐照不影响ALP阴性HEK293细胞的活力，所有细胞都发出绿色荧光。相比之下，ALPIN-4I处理的HeLa细胞在660 nm照射下仍然存活，并发出绿色荧光。此外，通过使用caspase-3荧光探针GreenNucTM和凋亡荧光探针Annexin V-mCherry，发现ALPIN-6I在PDT处理HeLa细胞后死亡的主要机制是凋亡。为了进一步证明ALPIN-6I对ALP阳性癌细胞的杀伤选择性，我们将这种可激活的PS与HeLa细胞和cpyfpencode的HEK293细胞混合孵育。大部分HeLa细胞呈现红色荧光，而发出黄色荧光的HEK293细胞在该通道中保持黑暗，表明ALP过表达的HeLa细胞被选择性杀死，而不影响ALP阴性的HEK293细胞。这些结果有力地支持了ALPIN-6I作为一种高度ALP特异性的PS。ALPIN-6I在体内的研究从ALPIN-6I处理的HeLa肿瘤移植小鼠的荧光监测开始。ALPIN-6I比其游离的对应物ALPIN-4I显著增加了荧光信号在肿瘤中的保留。此外，用ALP抑制剂(Na3VO4)预处理肿瘤有效地阻断了肿瘤的荧光发射。ALPIN-6I的肿瘤定位作用弱于ALPIN-6。这可能是由于ALP激活后ALPIN-6I的荧光发射比ALPIN-6弱得多。离体图像进一步证实了ALPIN-6I的生物分布。除了HeLa肿瘤外，我们还观察到肝脏和肾脏有相当数量的荧光发射，这两个地方都有增加的ALP活性。基于PDT的治疗既依赖于PS的存在，也依赖于光的照射;通过精确控制照射光，可以最大限度地减少pdp治疗对这些重要器官的影响。
ALPIN-6I体内肿瘤治疗研究
在HeLa细胞接种后第12天，将ALPIN-6I通过尾静脉注射到裸鼠体内，然后用660nm激光(0.2 Wcm 2)照射HeLa肿瘤部位，研究其体内抗肿瘤效果。每2天监测HeLa肿瘤体积，评价抗肿瘤效果。第16天，我们观察到肿瘤体积基本保持不变。作为对照，未经照射而接受ALPIN-6I的小鼠肿瘤体积明显增加。第16天，我们再次给药ALPIN-6I，并将660 nm激光强度从0.2 Wcm 2提高到0.5 Wcm2，以增强PDT的疗效。令我们高兴的是，两天后，我们观察到肿瘤大小明显减小，并且所有被测试的小鼠(n=4)在第20天完全抑制实体瘤。对小鼠的解剖进一步证实了这一点。在整个PDT过程中，对小鼠的体重进行监测，未观察到明显变化。相比之下，对照组的肿瘤继续增大。采用最佳辐照剂量(660 nm, 0.5 Wcm2, 10 min)再次检测ALPIN6I的体内疗效。本研究采用三组HeLa荷瘤小鼠，分别给予ALPIN-6I、ALPIN-4I和PBS处理。在HeLa细胞接种12天后静脉注射ALPIN-6I、ALPIN-4I和PBS，然后照射。仅用ALPIN-6I治疗2天后，观察到肿瘤体积显著减小，而ALPIN-4I和其它对照组肿瘤继续生长。经2次静脉给药和4次照射后，小鼠HeLa肿瘤在第16天几乎检测不到。第30天，ALPIN – 6I治疗小鼠的肿瘤完全消失，这些小鼠(n=4)完全康复。相比之下，由于HeLa肿瘤过大，接受ALPIN-4I或PBS的小鼠在第20天被处死。ALPIN-6I在PDT治疗中的高效化可归因于其在小鼠肿瘤中的高保留和富集。这促进了单线态氧的产生，并消耗了游离硫醇，如抗氧化剂谷胱甘肽，它可以协同抑制癌细胞。在整个PDT治疗过程中，通过监测小鼠的体重来评估ALPIN-6I对小鼠的潜在副作用。第30天取大鼠主要脏器，如心、肝、脾、肺、肾和肠，进行苏木精和伊红(H&E)组织学分析。ALPIN-6I处理小鼠的结果与PBS处理小鼠的结果相似，表明ALPIN-6I是一种高度生物相容性的试剂。在PDT治疗中，单次给药和照射对癌症治疗更有吸引力。为了研究这种可能性，我们按照上述方案对HeLa肿瘤异种移植小鼠进行了ALPIN-6I测试，但只有一次静脉注射ALPIN-6I和照射。令我们高兴的是，在PDT后仅两天，所有受试小鼠(n=3)的肿瘤就被完全抑制了。这些小鼠没有出现明显的体重减轻或主要器官异常，证明了这种酶激活光敏剂的高效率。
结论
我们提出了一种多效策略来设计酶激活成像试剂和光敏剂开发了一种ALP 活性的 NIR探针(ALPIN-6)和一种光敏剂(ALPIN-6I)。在ALP的单一刺激下，通过释放亲水单位从亲水性变为疏水性，从而变得抗扩散和细胞渗透性；与细胞外膜蛋白共价结合，形成活性醌类中间体在细胞内积累;显示开启近红外荧光或光敏能力。这种近红外探针兼容活细胞中ALP活性的免洗实时成像，信本比超过2000倍，具有持久荧光的体内成像。ALP活化光敏剂ALPIN-6I可以在ALP过表达的肿瘤细胞中选择性活化和富集，其浓度比培养基增加2000倍以上。活性光敏剂在肿瘤细胞内的高富集也导致游离硫醇减少50%，这可能进一步增强PDT的功效。在近红外激光(660 nm)照射下，这种多效光敏剂促进ALP过表达的癌细胞产生单线态氧，即使在ALP阴性细胞存在的情况下也能选择性地抑制癌细胞。体内研究证实了这种ALP活化的敏化剂对PDT治疗的特殊疗效；所有小鼠ALP过表达的HeLa肿瘤均被完全切除。该研究展示了这种多效策略在激活和递送近红外成像试剂和光敏剂到ALP过表达肿瘤中的有效性，该方法可用于设计其他肿瘤相关酶的荧光探针或光敏剂。
参考文献
Enzyme-Activatable Near-Infrared Photosensitizer with High Enrichment in Tumor Cells Based on a Multi-Effect Design , Yuyao Li, Chaoying Zhang, Qingyi Wu, Yan Peng, Yiru Ding, Zhengwei Zhang, Xiaoyong Xu, and Hexin Xie*， Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202317773，https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.202320072
