内容提要
一氧化氮(NO)具有促肿瘤和抗肿瘤的双重作用。因此，实时体内成像和肿瘤NO动力学的量化对于理解NO在病理生理中所起的冲突作用至关重要。然而，目前的分子探针无法提供深层组织的高分辨率成像。我们设计了一种最大吸收超过1000 nm的光声探针，用于体内肿瘤NO动力学的高空间定量成像。该探针具有显著的灵敏度、选择性比率响应行为和良好的肿瘤靶向能力，有助于在微分辨率水平上对肿瘤进展过程中的NO进行比率成像。利用该显像剂，成功地定量了NO在肿瘤、肝脏和肾脏中的动态变化，确定了NO的基本浓度阈值约为80 nmol/cm3，这在NO在肿瘤中的“双刃剑”功能中起着至关重要的作用。此外，我们揭示了肿瘤中NO浓度与肝脏中NO浓度之间的反比关系，为肿瘤与肝脏之间可能的NO介导的通讯提供了初步的见解。
实验结果与讨论
探针的设计与NO响应研究
在SPAno1探针的设计中，将N-甲基-4-乙烯苯胺偶联到位置作为NO响应基团和给电子基团。由于推拉效应和共轭效应的协同作用，SPAno1的最大吸收红移至1010nm。在与NO反应后，N -甲基苯胺发生亚硝化，抑制了分子内电荷转移效应，从而使最大分子吸收降至950 nm。因此，SPAno1对NO的比例响应可以通过探针与NO反应前后吸收波长的变化来实现。我们还在SPAno1的基础上引入聚醚链(PEG)作为水溶性基团，引入生物素作为肿瘤靶向基团，开发了SPAno2，实现了对其水溶性和肿瘤靶向功能的调节。在PBS缓冲液中，SPAno1−2在1010 nm处具有λabs的NIR-II吸收带。SPAno - 2在1240 nm附近显示弱荧光带，低量子产率(Φf)测定SPAno1−2为1%，SPAno2为0.7%。这些探针的激发态弛豫主要是由非辐射衰变途径主导的，这将是获得优越的PA性能的首选途径。为了研究SPAno1−2的反应性，我们评估了吸收光谱对不同NO浓度的响应。当不同浓度的NO加入到SPAno1−2溶液中时，1010 nm处的吸光度线性下降，并在950 nm处出现新的吸收峰。当NO浓度达到20 M左右时，SPAno1−2的吸收光谱基本保持不变，表明SPAno1−2完全转化为亚硝化产物。生理条件下SPAno1−2优先与NO反应。只有当SPAno1−2与NO反应时，Abs950/Abs1040发生了变化，而其他金属离子、阴离子、氨基酸和活性氧没有发生变化。由于SPAno2具有良好的水溶性和潜在的肿瘤靶向能力，因此我们选择SPAno2作为模型化合物进行以下体外和体内PA成像。我们评估了PBS缓冲液中SPAno2对NO的反应，并评估了其体外比例成像能力。暴露于NO前后的SPAno2的吸收光谱表现出明显而明确的光谱特征，表明该探针具有良好的水溶性。我们使用1040和950 nm激光器作为激发源，进一步研究了SPAno2的比例成像能力。在SPAno 2的PBS溶液中加入NO后，1040 nm通道的PA强度逐渐降低，而950nm通道的PA强度增加，导致PA比(PA950/PA1040)增加了3.1倍，发现了比例与NO浓度之间的正线性相关。利用这种相关性，我们计算出SPAno2的PA检测限低至42.6 nM。这些发现为SPAno2在体内NO比率成像的适用性提供了令人信服的证据。
NO在肿瘤中的光声成像研究
MTT(3(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑)实验显示，在浓度为50 μM时，SPAno2对HepG2、Hela和MCF-7细胞的活性影响可以忽略不计。此外，苏木精和伊红(H&E)染色对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和肿瘤组织进行分析，未见明显改变。这些结果证实了该探针具有良好的生物安全性，表明其适用于体内PA成像。为了验证SPAno2的高分辨率成像能力，我们使用3D成像方式对野生型(WT)小鼠模型进行了NIR-II PA成像。在对照组中，WT小鼠模型在790和1040 nm通道均显示背景PA信号。值得注意的是，1040nm通道的PA强度比790nm通道弱约0.5倍，说明NIR-II激发波长可以有效降低背景信号的干扰。在WT+PAno2和WT+SPAno2组中，分别注射PAno2和SPAno2后，在790 nm和1040 nm通道PA强度显著增加。肝脏横断面分析显示，在9.4 mm的组织深度，SPAno2的PA信号清晰可见，而在相同的成像深度，PAno2与背景无法区分。此外，WT+SPAno2组的信号背景比(SBR)约为WT+PAno2组的1.5倍。这些观察结果表明，与PAno2相比，SPAno2具有更好的穿透深度，这表明NIR-II探针与NIR-I探针相比，在高分辨率体内PA成像应用方面具有更大的潜力。我们采用三维双通道PA断层成像技术研究NO在4T1肿瘤中的时空分布信息。如图3b所示，注射PBS作为对照组(肿瘤+PBS)的肿瘤小鼠在950和1040 nm通道均显示弱背景PA信号。随后，我们检测了肿瘤中SPAno2的时空积累。尾静脉注射后，随着时间的推移，PA950/PA1040比值逐渐升高，表明探针转化为n -亚硝化产物。并且，比值值在注射后3 h达到最大值，之后逐渐减小，说明SPAno2在注射后3 h左右表现出最佳的NO成像能力。注射后3小时的成像结果(肿瘤+SPAno2组)显示950 nm通道的PA强度显著增强，1040 nm通道的PA强度略有增加。因此，得到的PA950/PA1040比值值比肿瘤+PBS组高约5.4倍。比值值的大幅增加使比值图像能够提供更清晰的肿瘤轮廓和清晰的信号分布模式。我们通过研究肿瘤内不同深度PA信号的比值来研究N-亚硝化产物的空间分布。成像结果显示，随着时间的增加，从1 h到3 h, PA信号从肿瘤边缘向内部逐渐富集。重要的是，PA信号在肿瘤组织的不同深度表现出相对均匀的分布，表明NO在肿瘤内没有特定的分布模式。
不同大小肿瘤中NO的浓度的光声成像研究
我们进一步测定不同大小肿瘤中NO的浓度，比较比值PA值与NO浓度水平的关系。注射SPAno2后3 h，获得不同大小肿瘤的PA图像。分布结果一样，PA信号在不同大小的肿瘤中也没有特定的空间分布，这有利于提供更准确的信号强度。我们发现，在50 ~ 200 mm3范围内，肿瘤的比值PA值随肿瘤大小呈正相关增加。为了验证组织中NO的扩散是否影响PA成像结果，在体内PA成像完成后，我们立即收获相应的肿瘤，在相同的实验条件下再次对肿瘤组织进行比例成像。体内肿瘤的PA信号比与体外肿瘤组织的结果几乎一致，这一结果证实了SPAno2在体内NO PA成像肿瘤的可靠性。同时，通过Griess试剂盒法测定肿瘤大小依赖性NO浓度。NO浓度随肿瘤大小从43 ~ 77 nmol/cm3缓慢升高。重要的是，我们可以进一步定量地将比值PA值与体内NO浓度联系起来。根据得到的NO浓度与比例PA成像的定量关系，我们还对不同肿瘤大小荷瘤小鼠肝脏和肾脏的NO浓度进行了评估。如图所示，不同于不同大小的肿瘤中NO水平的升高，肝脏部位的NO浓度随着肿瘤大小的增加而降低，而在相同大小范围的肿瘤中，肾脏部位的NO浓度基本保持不变。H&E染色结果显示肝组织内没有转移性肿瘤细胞，提示在肿瘤发展过程中可能参与了一氧化氮介导的肝脏与肿瘤之间的通讯。此外，我们在MDA-MB-231肿瘤和KG1肿瘤模型中应用所获得的NO浓度与比例PA成像的定量关系。结果表明，光声成像数据分析得到的NO浓度与体外Griess试剂盒法测定的结果基本一致。
NO的浓度动态变化的光声成像研究
在确定SPAno2可用于体内NO的准确定量后，我们进一步评估了4T1荷瘤小鼠在药物治疗期间肿瘤和肝脏、肾脏中NO的动态变化。硝普钠(SNP)是一种临床批准的药物，以其在治疗学中的NO供体和血管扩张剂的作用而闻名。SNP已被证明通过体内还原催化剂或血管组织代谢产生NO来发挥其抗癌作用。然而，由于体内SNP会自发和非选择性地释放NO，因此确定各器官中的NO浓度仍然具有挑战性。为了阐明SPAno2是否可以作为临床环境中精确监测NO水平的可靠工具，我们研究了荷瘤小鼠中SNP的NO释放。在我们的实验设置中，肿瘤体积为200 mm3的模型小鼠接受不同剂量的SNP静脉注射。1 h后静脉注射SPAno2 (150 μL, 100 μM)。随后，我们采用3D-PA成像来评估NO在肿瘤和不同器官中的作用。当SNP浓度增加时，不同深度截面肿瘤的PA信号主要由肿瘤边缘向内部富集。同时，PA比强度逐渐增大。肝脏和肾脏的比值信号强度也显示了类似的结果。根据NO浓度与比值PA信号的定量关系，我们计算了三个器官NO浓度的变化情况。虽然一氧化氮浓度在所有这些器官中都有增加的趋势，但在相同SNP浓度下，这种趋势在肝脏和肾脏中更为明显。这一结果表明，SNP的非靶向no递送和爆发性释放可能对肿瘤以外的其他器官产生副作用。此外，为了进一步验证NO定量的准确性，我们采用Griess试剂盒法测定了PA成像后立即收获的相应肿瘤的NO浓度。检测到的NO浓度与定量计算基本一致，进一步证明了结合比例3D-PA成像对探针SPAno2体内NO进行定量的能力。在明确了SNP对肝脏和肾脏的副作用后，我们进一步研究了在整个SNP治疗过程中肿瘤与各器官之间NO水平的动态波动。此外，为了进行比较，我们使用了顺铂(CDDP)，一种非NO供体药物。我们将4T1细胞皮下注射到裸鼠右胸腔。从第4天开始，我们通过尾静脉注射SNP和CDDP治疗荷瘤小鼠，记为SNP组和CDDP组，PBS组为对照组。治疗方案如图5a所示。我们在治疗过程中监测肿瘤体积的变化。到第8天，我们观察到明显的肿瘤生长，随着治疗时间的延长，SNP的抗肿瘤作用越来越明显。因此，结合SPAno2，我们在第1、8、13和18天对三组小鼠进行了三维光声成像，以量化肿瘤、肝脏和肾脏内NO的浓度。肿瘤切片内的PA信号比在治疗开始时明显增加，随着治疗时间的延长最终趋于稳定。通过建立NO浓度与PA信号比之间的相关性，可以明显看出，SNP和CDDP组在整个肿瘤生长过程中始终保持肿瘤NO浓度超过80 nmol/cm3，而对照组的肿瘤NO浓度始终低于80 nmol/cm3。这种模式与体外Griess试剂盒检测方法获得的结果一致。提示肿瘤NO浓度超过80 nmol/cm3时，可抑制肿瘤生长，低于80 nmol/cm3时，可促进肿瘤生长。随后，我们分析了肝脏和肾脏的横切面图像。在SNP和CDDP组中，随着治疗时间的延长，肝脏和肾脏的PA信号比呈上升趋势，尽管与肿瘤相比明显降低。同时，体外Griess试剂盒测定NO浓度也呈现同样的升高趋势，进一步说明药物治疗对肿瘤以外的器官有不同程度的影响。与肝脏NO浓度随肿瘤体积增大而降低的观察结果一致，对照组随着肿瘤体积增大(> 8天)，肝脏PA信号比值逐渐降低，肝脏NO浓度也随之下降。为了解释这一现象，我们对肿瘤和肝脏组织切片进行了免疫荧光染色分析。在对照、SNP和CDDP组中，肿瘤内内皮细胞NOS (eNOS，绿色信号)的表达几乎可以忽略不计，而诱导的NOS (iNOS)和神经元NOS (nNOS)则表现出整体表达。这一发现与之前报道的结果一致。在第8天左右，肝脏中eNOS和iNOS的表达趋于稳定，而nNOS的表达明显下降，这与肝脏NO浓度的下降趋势一致。这表明，在肿瘤生长过程中，肝脏内一氧化氮含量的减少可能是导致肝脏一氧化氮浓度下降的主要原因。因此，nNOS有望成为未来研究肿瘤-肝脏相互作用的关键生物标志物。
总结
我们开发了一个NIR-II型no响应比例型PA探针家族，SPAno1−2。这些探针对NO具有很高的灵敏度和极好的选择性比率响应。与NIR-I PA探针相比，NIR-II探针SPAno2在体内深部组织中表现出更高的分辨率。重要的是，由于其水溶性和肿瘤靶向能力，SPAno2在肿瘤进展过程中实现了肿瘤NO的比例高空间分辨率成像，从而为定量检测体内NO浓度提供了机会。通过建立比值PA信号与NO浓度之间的定量关系，我们成功地量化了肿瘤发生和药物治疗过程中肿瘤、肝脏和脾脏中的NO动态。我们确定80 nmol/cm3是控制NO“双刃剑”功能的关键浓度阈值。当肿瘤内的浓度超过这个阈值时，肿瘤生长受到抑制，而当浓度低于这个阈值时，肿瘤生长受到刺激。此外，我们的研究揭示了肿瘤中NO浓度与肝脏中NO浓度之间的反比关系。机制研究表明，肝脏中nNOS表达减少可能是肝脏内NO水平下降的主要因素。这些发现为在肿瘤发展和药物治疗过程中肿瘤和肝脏之间潜在的NO介导的通讯提供了初步的见解。这些结果表明，SPAno2是一种很有前景的肿瘤NO高分辨率成像工具，同时，NO的无创定量对肿瘤诊断和抗癌药物筛选具有重要意义。
参考文献
A NIR-II Photoacoustic Probe for High Spatial Quantitative Imaging of Tumor Nitric Oxide in Vivo,Zhiyong Jiang, Changli Zhang , Qian Sun , Xiaoqing Wang, Yuncong Chen, Wejiang He , Zijian Guo and Zhipeng Liu*, Angew. Chem. Int. Ed , https://doi.org/10.1002/anie.202320072
