内容提要
荧光成像是研究生物过程的宝贵工具，进一步的进展取决于先进的荧光探针的发展，这些探针可以到达细胞内目标并以高特异性标记它们。优异的荧光罗丹明染料已被报道，但它们通常需要长时间和低产量的合成，并且光谱限制在可见范围内。在这里，我们提出了一种利用分子内环闭合方法将多甲基化合物转化为荧光染料的一般策略。我们通过创建自发闪烁和免洗，开启的聚甲基染料在可见光和近红外光谱上的发射来说明这种方法的普遍性。这些探针与自标记蛋白和小分子靶向配体兼容，并可与罗丹明基染料结合，用于多色和荧光寿命复用成像。这种策略提供了一种明亮的荧光染料，与现有的罗丹明基染料相比，这种染料发出的波长更红移。
实验结果与讨论
探针设计与理论计算
一种有效的荧光染料必须完全以非荧光形式存在，除非它与预定的目标结合。在基于环化的荧光性的情况下，这意味着环打开和关闭的势垒必须分别高和低。极性环化反应的有利性可以使用称为Baldwin规则的启发式准则来估计。在过去创建荧光性花菁染料的尝试中，分子内环化是5-内三角型的，根据Baldwin规则，这是不利的。这种环化被归类为5-内三角，因为它涉及到一个五元环的形成。虽然6-内三角环化应该比5-内三角环化更有利，但过去使用6-内三角环化的尝试并没有导致更稳定的环异构体。我们假设5-外三角环化——在双键攻击时形成的单键不包含在新形成的环中——将是一个更有效的选择。为了验证我们的假设，我们使用密度泛函理论(DFT)来计算HMSiR(1)的开环和闭环能量(HMSiR是一种硅罗丹明衍生物，具有高效的5-外三角分子内环化反应)。我们将这些值与分别经历5-内三角、6-内三角和5-外三角环化的Cy5衍生物2、3和4a的计算值进行了比较。HMSiR(1)比Cy5衍生物2和3具有更大的开环能量和更小的闭环能量，它们分别经历了5和6内三角环化。相比之下，Cy5衍生物4a(经历5外三角环化)的开环和闭环能量与HMSiR(1)的计算值相当。我们还观察到，在Cy5染料上明智地加入吸电子基团进一步提高了封闭异构体的稳定性，允许额外调制环打开和关闭的能量。这些预测表明，通过采用5-外三角环代替5-内三角环，可以获得更强的荧光多甲基染料。
探针的细胞荧光成像
为了验证这些计算预测，我们制备了吲哚构建块5、6、7a-d和连接体8。接下来，我们用微波辅助的两步合成了5-内三角Cy5探针2a和2b。5-外三角Cy5探针4a和4b通过甲酯中间体9a-d分两步制备，然后用LiAlH4还原。我们对这些Cy5衍生物进行了pH滴定，以评估封闭异构体的稳定性。5-内三角探针的pH滴定显示，环开口pKa值高于生理pH (2a为11.1,2b为8.5)，表明这些探针作为细胞中的自由小分子具有高荧光性。相比之下，5-exo-trig探针的开环pKa值低于7 (4a为6.4,4b为5.7)，表明它们可能仅在酸性隔间中显示一些荧光。在活细胞成像实验中， 5-内三角探针2a和2b在线粒体中显示出明亮的荧光。这种亚细胞定位可能是开放Cy5支架正电荷离域的结果。5-外三角探针4a和4b只显示出非常微弱的荧光，荧光主要定位在溶酶体中。这些结果证实，经过5-外三角环化的探针的封闭形式在生理条件下非常稳定，并极大地减少了活细胞成像中的非特异性背景。我们研究了是否可以通过将染料4b偶联到自标记蛋白标签上诱导荧光开启。鉴于HaloTag已经对罗丹明染料进行了彻底的优化，我们选择使用snaptag，从而提供了一个正交系统，可用于罗丹明和HaloTag的多路复用研究。我们使用重氮试剂FSO2N3合成了叠氮修饰的SNAP-tag配体10，并将其与炔修饰的Cy5染料4c结合，通过点击反应生成探针11。当与纯化的snap标签蛋白孵育时，该染料显示出10倍的吸光度和21倍的荧光，表明其与自标记标签结合后具有荧光性。使用SNAP-tag与组蛋白H2B片段融合的活细胞实验表明，尽管化合物11的细胞摄取与其5-内三角衍生物相比没有增强，但它更有效地标记SNAP-tag并显示更少的非特异性信号。重要的是，探针11被设计成模拟HMSiR(1)中的环化平衡，这是一种对SMLM有用的自发闪烁荧光团。因此，为了评估探针11的自发闪烁特性，我们在HeLa细胞中表达了与β-微管蛋白融合的snap标签，并用化合物11处理这些细胞。我们在没有任何闪烁或抗褪色剂的生长培养基中进行了活细胞SMLM成像。这些实验表明，探针11确实显示自发闪烁，允许获得超分辨荧光图像。探针11的单分子定位精度为18±6nm，在活细胞中测量微管的宽度约为60 nm。
Cy5衍生物在荧光细胞成像中的应用
我们应用5-外三角环闭合策略来开发一种免洗荧光Cy5衍生物。我们将9c的甲酯基转化为N-甲基酰胺12，并制备了相应的5-内三角吲哚啉13和Cy5探针14。这些含炔衍生物与苄基鸟嘌呤10偶联，生成探针15和16。这些染料与纯化的SNAP-tag蛋白孵育后，化合物15的吸光度增加了6倍，荧光增加了19倍。与SNAP-tag结合不仅诱导开环，而且与溶液中的游离染料相比，化合物15的发射量子产率也增加了。化合物16与SNAP-tag结合后，吸光度和荧光分别仅增加1.4倍和2.5倍。探针15的体外荧光性与苄基鸟嘌呤功能化的JF646染料(JF646- bg)用于snap标签标记的荧光性相当。这一观察证实，花菁染料的5-外三角环化可以在与蛋白质靶标结合时逆转，类似于罗丹明的开启机制。我们用编码融合蛋白H2B-SNAPf-mTurquoise2的质粒转染HeLa细胞，并用染料15、16或JF646-BG孵育。探针15在细胞核中显示出明亮的荧光信号，只有非常微弱的非特异性背景信号。该性能与JF646-BG相当。另一方面，探针16显示的荧光信号弱10倍以上，表明它可能膜渗透较少。此外，探针16在囊泡中显示了大部分荧光信号，证实了5-内三角Cy5衍生物不适合作为免洗开启染料。最后，我们用编码非靶向SNAPf-mTurquoise2融合蛋白(全细胞)、LifeAct-SNAPf-mTurquoise2(肌动蛋白)或TOM20-SNAPf-mTurquoise2(线粒体)的质粒转染HeLa细胞，测试探针15标记的通用性。通过参考荧光蛋白mTurquoise2和与SNAP-tag连接的15的信号之间的良好覆盖来判断，在所有情况下，标记都是特异性的。外三角环闭合设计导致含有手性碳的吲哚胺片段。为了研究立体化学对染料在与SNAP-tag结合时开环的影响，我们使用手性固定相分离了6、(+)-6和(-)-6的对映体。我们利用电子圆二色性和时变密度泛函理论(TD-DFT)对两个对映体的绝对构型进行了赋值(扩展数据图3和方法)，发现(-)-6具有S绝对构型((+)-(R)-6和(-)-(S)-6)。我们分别使用每种对映体制备了对映体纯探针(R)-15和(S)-15。我们没有观察到每个对映体与纯化snap标签或活细胞成像结合时的显荧光性有实质性差异。我们假设染料的手性中心与蛋白质表面之间的相对较远的距离减轻了任何潜在的对映选择性结合相互作用;然而，我们认为可以利用这种相互作用进一步增加5-外三角聚甲基探针与手性靶标结合时的荧光性。
接下来，我们测试了与其他大分子靶标的结合是否也会诱导探针15的荧光开启。为此，我们制备了化合物17-actin和18-DNA。这些探针由5-外三角Cy5衍生物组成，通过含三唑的烷烃连接到肌动蛋白结合环沉积肽jasplakinolide或Hoechst 33342 -一种与双链DNA (dsDNA)的小凹槽结合的染料，并已被用于将荧光罗丹明染料靶向细胞核。探针17-actin在体外与肌动蛋白丝结合后显示出11倍的吸光度和313倍的荧光特性。与吸光度增加相比，更大的荧光开启表明与肌动蛋白结合显著提高了碳菁17的量子产率。在活细胞成像实验中，17-肌动蛋白选择性地在未修饰的活HeLa细胞中标记肌动蛋白纤维。18-DNA也得到了类似的结果，与双链DNA结合后，吸光度增加了7倍，荧光增加了32倍。活细胞成像也证实了细胞核的特异性染色。这些结果表明，5-外三角Cy5衍生物的致荧光性不仅限于SNAP-tag，其他大分子也可以诱导荧光开启。
Cy3和Cy Cy5衍生物在荧光细胞成像中的应用
我们探索了5-外三角荧光策略是否可以扩展到Cy3和Cy7染料，为两个额外的成像通道提供荧光团。我们怀疑Cy3的导数会比Cy5有更高的LUMO能量，而Cy7的导数则相反;因此，我们预计Cy3染料比Cy5染料更有可能采用开放形式，而Cy7染料则倾向于采用封闭形式。为了平衡这些趋势，我们在顶层吲哚上添加了CF3片段，以支持Cy3的封闭形式。同样，我们在Cy7设计中用缺电子酰胺取代亲核N-甲基酰胺，以促进开环。我们制备了Cy3衍生物19和Cy7衍生物20用于snap标签标记。两种探针与纯化的SNAP-tag蛋白结合后均表现出荧光行为，吸光度分别为19的6倍和20的11倍，荧光度分别为19的28倍和20的124倍。与化合物15类似，荧光的大开启表明，与溶液中的游离染料相比，与SNAP-tag结合大大提高了这些探针的发射量子产率。随后，探针19和20被用于无水洗活细胞成像实验，用之前描述的H2B-SNAPf-mTurquoise2质粒瞬时转染HeLa细胞。我们观察到mTurquoise2参考信号分别与黄色和近红外荧光信号19和20具有良好的共定位，证实了探针的特异性。探针15、19和20覆盖了可见光谱的很大一部分，并到达近红外区域。探针15和20在与SNAP-tag结合时显示出优异的亮度和良好的光稳定性。Cy3衍生物19没有那么亮或光稳定性，但这些性能可以通过引入取代基或使聚甲基链更刚性来进一步调整。最后，我们将探针应用于多色成像实验。首先，我们使用荧光性Cy5染料15与广泛使用的JF549-Halo染料联合进行了多色成像实验。我们通过在共转染H2B-SNAPf-mTurquoise2和TUBB5-HaloTag的活HeLa细胞中成像15/JF549-Halo对，证实了荧光探针与罗丹明- halotag偶联物的正交性。接下来，我们探索了具有几乎相同激发波长和发射波长的Cy3衍生物19和jf549 - halo的荧光信号是否可以通过它们的激发态寿命来分离。我们用H2B-SNAPf-mTurquoise2和TUBB5-HaloTag共转染HeLa细胞，并进行荧光寿命成像(FLIM)。虽然信号不能通过波长来区分，但通过相量图分析，可以很容易地通过它们的平均激发态寿命来区分它们。
总结
我们提出了一种通过5-外三角环闭合方法赋予花菁染料的一般策略。我们通过生成自发闪烁的Cy5染料、荧光性Cy3和Cy5染料以及明亮且光稳定的近红外荧光性Cy7，说明了我们的荧光性聚甲基支架的潜力。Cy7衍生物探针20由于其高亮度和长发射波长而特别有趣。此外，我们发现这些探针可以用于无洗共聚焦活细胞显微镜和SMLM,它也可以与广泛使用的罗丹明-卤素标签缀合物结合在多色和多路寿命成像实验中使用。我们通过使用自标记蛋白标签SNAP-tag，以及jasplakinolide或Hoechst 33342染料来驱动荧光开启，证明了我们的开启策略的通用性。内酰胺环与核酸中蛋白质或磷酸基团中普遍存在的酰胺之间的特定相互作用(例如氢键)可以触发开环。包括分子动力学模拟和位点定向诱变在内的更详细的研究可以进一步阐明特定5-外三角聚甲基染料的荧光开启机制。鉴于多甲基染料的高模块性，光谱范围可以进一步扩展到绿色以及短波红外(Cy9染料)波长。此外，多甲基染料的光物理性质和荧光性可以通过改变吲哚胺或连接体上的取代基来进一步调整。这种简单而通用的方法将用于开发改进的荧光探针，促进新的生物成像实验。
参考文献
A general strategy to develop fluorogenic polymethine dyes for bioimaging , Annabell Martin & Pablo Rivera-Fuentes * , Nat. Chem., 2024, 16, 28-35. https://doi.org/10.1038/s41557-023-01367-y.
