内容提要
第二个近红外窗口(NIR-II)的分子成像提供了深层组织中生物病理事件的高保真可视化。然而，大多数NIR-II探针产生“始终在线”输出，并且对生物标志物的信号特异性较差。我们报道了一系列具有NIR-II窗口(715 - 1188 nm)可调发射可激活探针。这种发射波长的调控依赖于合理的分子工程，通过将苯并[c,d]吲哚，苯并[b]黄嘌呤和噻吩部分整合到传统的半花青素骨架上。特别是，HBC4和HBC5具有1050 nm以上的明亮和记录长的发射，与NIR-I荧光团HC1相比，可以提高组织穿透深度和肠道定位的信噪比。进一步构建可激活炎症报告基因(AIR-PE)，用于pH触发的结肠部位特异性释放。由于最小的背景干扰，口服AIR-PE可以通过实时NIRF-II成像清楚地描绘炎症性肠病(IBD)小鼠模型中的受激肠和评估治疗反应。得益于其高粪便清除率(>90%)，AIR-PE还可以通过体外光学粪便分析检测IBD并评估结肠炎治疗的有效性，优于典型的临床检测，包括粪便隐血检查和组织学检查。因此，这项研究提出了NIR-II分子支架，它不仅适用于开发多用途的可激活探针，用于深部疾病的早期诊断和预后监测，而且还有望用于未来的临床应用。
实验结果与讨论
NIR-II半花菁荧光团的设计
共轭骨架的延长是实现发射波长红移的有效方法。在这里，我们通过将三个结构域(结构域I - III)分别与苯并[c,d]吲哚、苯并杂蒽和噻吩基团偶联来定制骨架，这些结构域具有扩展的D -π−A结构，与上述基于多烯的罗丹明型荧光团相比，具有更刚性的共轭结构。这种共轭扩展显著地将hbc家族的最大发射从~ 750 nm调整到~ 1190 nm，比传统的HC1 (~ 715 nm)长~ 475 nm。HBC1 ~ HBC5在二氯甲烷中的吸收最大值分别为705、745、755、800和818 nm，分别比HC1 (~ 690 nm)长~ 15、55、65、110和128 nm。此外，HBC1−5染料在NIR-I和NIR-II区域表现出强烈的荧光，最大发射峰分别为735、825、850、1088和1188 nm，相对于HC1 (~ 715 nm)具有~ 20、110、135、373和473 nm的红移，表明它们具有用于NIR-II成像的潜力。HBC4和HBC5的nif - ii信号较亮，而HBC1−3和ICG的信号相对较弱。HBC2的线性π-扩展共轭优于HBC1的非线性π-扩展共轭，并且HBC2上的苯并[b]黄嘌呤尾部的酚基优于HBC1上的苯并[a]黄嘌呤中心苯环上的酚基，这可以通过波长发射更长(825 vs 735 nm)和光稳定性更好得到证明。此外，苯并[c,d]吲哚和苯并[b]黄嘌呤片段同时整合在HBC4的I和II结构域上，对向1088 nm的色移产生了“1 + 1 > 2”效应，并且HBC5在III结构域整合噻吩后甚至在1188 nm发出荧光。HC1的Stokes位移较小，约为~ 25 nm，而HBC1−5的Stokes位移较大，分别约为~ 30、80、95、288和370 nm，这可以大大减少激发光的干扰。HBC2-HBC5在PBS中具有很高的光稳定性，在连续激光照射30min下，荧光衰减可以忽略不计。相比之下，常规使用的ICG和HBC1出现持续的光漂白。基于这些结构性质的研究，HBC4和HBC5在超长波长荧光中脱颖而出。我们选择HBC4作为NIR-II的先导荧光团进行进一步的成像应用。
组织穿透和成像灵敏度
在体外和体内检测HC1和HBC4的穿透深度和成像敏感性。捕获含有HC1或HBC4的毛细管的荧光图像，覆盖不同厚度的1%脂质。在两个检测窗口，随着脂质内深度从0增加到10 mm，毛细血管的可见性变差。在nif - i波长窗口中观察到较浅的穿透深度(< 2mm)。相比之下，超过1000 nm的NIRF-II成像显示毛细边缘锋利，穿透深度大(6 mm)。此外，在脂内厚度为1.0、2.0、3.0、4.0 mm时，HBC4(47.6、28.6、13.5、6.2)的信本比(SBRs)分别是HC1(6.6、4.5、3.0、2.2)的7.2、4.5、2.8倍。这些结果表明，具有稳定NIR-II荧光信号的HBC4适合于体内深部组织成像应用。为了比较HC1和HBC4的成像灵敏度，我们对口服或静脉注射HC1或HBC4后的活体小鼠进行全身荧光成像获取荧光信号。为了防止探针在胃中过早释放，将HC1或HBC4嵌入FDA批准的两种聚合物PLGA和Eudragit S100的混合物中，分别称为HC1- pe或HBC4- pe，用于pH触发在结肠中特异性释放(结肠pH > 7)。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠、口服HC1- pe的小鼠和静脉注射HC1的小鼠中观察到腹部相同的nif - i信号。然而，口服HBC4- pe或静脉注射HBC4后，在腹部观察到强烈的nif - ii信号，但在pbs处理的小鼠中没有出现。口服或静脉注射HBC4后，活体小鼠的sbr分别比HC1高16倍和10倍。肠道对HC1的低成像敏感性归因于NIR-I而非NIR-II窗口食糜和排泄物的高自身荧光。因此，HBC4在活体小鼠肠道成像方面远优于HC1。在NIR-I窗口中，注射hc1和注射pbs的小鼠之间没有观察到显著差异，因为来自标准饮食的自身荧光降低了成像灵敏度。因此，在体外光学分析中，HBC4优于HC1。为了比较口服灌胃和静脉注射后HBC4在活体小鼠和切除器官中的生物分布，我们获得了荧光信号。给药后，影像学显示，静脉注射HBC4小鼠的肠道和肝脏中都观察到nif - ii信号，而口服灌胃HBC4- pe小鼠的肠道中只观察到nif - ii信号。在注射后3、6、9和12 h，灌胃小鼠的肠肝比值信号分别是静脉注射小鼠的14.3、21.3、12.4和7.5倍，说明灌胃后HBC4在肝脏的蓄积远小于静脉注射。因此，口服灌胃HBC4- pe优于静脉注射HBC4进行肠道显像。
可活化NIR-II炎症报告因子的合成与表征
在IBD的早期过程中，先天免疫细胞如中性粒细胞和巨噬细胞被招募，并可被刺激产生高杀菌力的次氯酸(HClO)，以操纵宿主与病原体的相互作用65此外，二/三肽转运体PepT1蛋白在正常结肠上皮细胞中不表达，但在溃疡性结肠炎中却高度上调由于三肽KPV (Lys-Pro-Val)和PepT1之间的相互作用，在我们的设计中选择65 KPV作为PepT1追踪溃疡性结肠炎的靶向片段。因此，我们合成了一个可激活的炎症报告因子(AIR)，它由三个关键功能片段组成，hcllocleavable片段、nif - ii HBC4荧光团单元和炎症相关的PepT1蛋白靶向片段(三肽KPV)。口服药物是一种更安全、更容易接受、成本效益更高的药物管理选择，特别是对胃肠道疾病。因此，将AIR或AIR- c分别封装到PLGA和Eudragit S100中，分别获得AIR- pe或AIR C-PE，以便在结肠pH下控制AIR或AIR- c的释放。为了研究AIRPE的光学性质和传感能力，记录了其在没有或存在ClO−时的吸收和发射光谱。AIR-PE在765 nm处显示出最大吸收，并且最初是非荧光的，因为荧光团单元处于“笼状”状态，其中芳香羟基的给电子能力减弱。暴露于ClO−后，吸收峰红移至800 nm。同时，AIR-PE在1088 nm处显示5.3倍荧光增强。这是由于二甲基硫氨基甲酸酯基团被ClO -切割，导致在荧光团上形成具有强给电子的酚酸基团的AIR-OH(“未束缚”状态)。1088 nm处的荧光信号与ClO -浓度呈良好的线性关系，检测限为~ 20 nm。在保留时间约为23 min时，检测到一个HPLC峰，进一步证实了二甲基硫氨基甲酸酯基团的裂解，该峰与未包裹的产物相对应(AIR-OH)。为了验证AIR-PE在炎症诱导的活细胞中检测ClO−的能力，将RAW264.7细胞接种到96孔板中，用PBS或zymosan培养(ZMS是酵母细胞壁的多糖部分，用作诱导炎症的模型药物)。细胞用AIR-PE或商用探针罗丹明B胺(Rho)孵育。使用小型动物成像系统捕获细胞的荧光图像。在没有ZMS的情况下，AIR-PE或罗丹明B胺处理的RAW264.7细胞表现出微弱的信号，表明细胞内探针被基础水平的ClO−轻微激活。然而，在ZMS存在的情况下，Rho或air - pe处理的raw264.7细胞呈现出强烈的荧光信号，相对于对照细胞显示出高1.4倍和2.6倍的信号，这是因为ZMS刺激炎症。这些结果证实了在RAW264.7细胞中，AIR-PE的nif - ii信号可以被ClO−激活。
IBD早期诊断的NIRF-II成像和粪便分析
为了评估AIR-PE对IBD实时成像和粪便分析的能力，我们使用DSS(葡聚糖硫酸钠)，以毒性剂量(水中4%)灌胃诱导结肠炎68对照组小鼠给予PBS治疗。在DSS治疗后的不同时间点(0、3、6天)，给活小鼠口服AIR-PE或对照探针AIR-CPE，然后进行纵向NIRF-II成像。在整个成像过程中，nif - ii成像未能描绘出对照组小鼠的肠道。然而，在dss治疗后3天，在AIRPE灌胃后3小时，肠道被清晰地描绘出来，这表明炎症期间，空气- pe被上调的ClO−激活。炎症肠道的信号逐渐增加，在AIR-PE灌胃后6小时达到最大值，与健康对照小鼠相比，信号增加了3.1倍。在dss治疗后6天，小鼠观察到类似的信号进化，最大肠道信号是对照小鼠的8.7倍，表明在IBD的进展过程中ClO -水平逐渐升高。此外，我们还进一步研究了AIRPE与AIR-C-PE的炎症靶向能力。灌胃后6 h，腹膜AIR-C-PE的nif - ii信号比AIR-PE低1.8倍。此外，离体成像研究显示，结肠区域AIR-PE的nif - ii信号比AIR-C-PE高约2倍，表明KPV工程增强了探针在炎症部位的积累。为了评估AIR-PE的转化潜力，采用光学分析方法远程检测IBD。为了将粪便信号与IBD期间的炎症联系起来，在口服AIR-PE后，记录小鼠粪便中排出的AIR-OH的NIRFII信号。在dss治疗后3天(1.8倍)观察到第一个具有统计学意义的nif - ii增强，并且在6天(9.4倍)继续增强。为了比较AIR-PE与临床/临床前方法的检测能力，采用结肠长度、粪便潜血试验(FOBT)、组织学检查、免疫荧光染色和细胞因子检测来评估IBD。结肠长度是肠道病理指标，dss治疗后6天结肠长度明显缩短，3天没有变化。同样，与对照组小鼠相比，第6天观察到FOBT严重程度明显升高，体重明显减轻。此外，DSS处理组中性粒细胞标记物Ly6G和商业探针罗丹明B酰胺的免疫染色显示出更强的绿色信号，表明DSS刺激后HClO的产生和炎症免疫细胞(中性粒细胞)向粘膜和粘膜下层的浸润。DSS处理小鼠结肠中促炎细胞因子TNF-α(3.6倍)和IL-1β(4.6倍)水平升高，表明炎症反应增强。
NIRF-II成像和分析用于IBD的预后评估
在证明了AIR-PE对IBD的早期诊断能力之后，我们进一步评估了它在评估结肠炎治疗有效性方面的效用。为了减轻溃疡性结肠炎，dss治疗小鼠分别给予甲硝唑(MTZ)、69 5-氨基水杨酸(5-ASA)、70氢化可的松(HC)、71或胆红素(BR)72等代表性药物， pbs治疗组作为对照。在各种治疗后，AIR-PE被口服给活小鼠。注射后12 h进行纵向nif - ii成像和粪便分析，定量分析肠道部位和粪便的信号。在AIR-PE注射后6小时，MTZ、5-ASA、HC或BR处理小鼠的nif - ii信号分别比pbs处理组低0.44、0.35、0.33或0.23倍。此外，在粪便分析中观察到平行信号趋势，表明与pbtreatment组相比，MTZ、5-ASA、HC或br处理小鼠的粪便信号相应减少0.45、0.25、0.17或0.16倍。值得注意的是，在br处理的小鼠中，nif - ii信号几乎完全减弱，粪便信号降低到健康小鼠背景的相当水平。此外，与PBS对照组相比，这些结肠炎疗法抑制了粪便隐血，减轻了所有药物治疗组的小鼠体重减轻和结肠长度缩短。为了深入了解治疗机制，对结肠组织进行了免疫荧光染色。与pbtreatment组相比，在接受各种结肠炎治疗的小鼠中观察到Ly6G+中性粒细胞减少，MTZ、5ASA、HC或br处理的小鼠的绿色免疫荧光信号分别比pbs处理组减少0.83、0.26、0.19或0.14倍。组织学研究显示，接受结肠炎治疗的小鼠组上皮破坏和粘膜下水肿较少。此外，MTZ(0.33和0.54)、5ASA(0.23和0.34)、HC(0.31和0.32)或BR(0.20和0.12)组小鼠结肠中TNF-α和IL-1β水平显著低于pbs处理组，表明结肠炎治疗可以减少炎症的发生。为了评估所有检测方法的敏感性和特异性，进行了受试者工作特征(ROC)分析。与结肠长度(AUC = 0.15)和细胞因子(0.90 - 0.94)对预后评估的有限预测能力相反，基于air - pe的nif - ii成像和粪便分析具有高度歧视性，分别产生较高的AUC值0.97和0.98。因此，基于air - pe的粪便分析对IBD的预后评估具有最高的敏感性。
总结
使用光学成像诊断和治疗IBD的一个基本问题是肠道食糜和排泄物的高自身荧光和nif - i窗口的低成像能力。我们报道了一系列具有记录长波发射的荧光半花菁(HBCs)骨架，用于通过nif - ii成像早期诊断和监测IBD的预后。这些骨架是通过将苯并[c,d]吲哚、噻吩和苯并[b]黄嘌呤基团结合到传统的半苯胺支架上形成的，这可能会扩大π共轭作用，并产生现有半苯胺未报道的明亮和超长波长荧光。代表性骨架HBC4在1088 nm处发射明亮，与NIR-I荧光HC1相比，成像深度显著提高，能够清晰地显示肠道。进一步构建IBD报告蛋白AIR-PE，方法是将HBC4支架的酚基与次氯酸可裂解片段笼化，然后与靶向三肽的炎症相关转运蛋白PepT1偶联，并包封成两种聚合物。药代动力学研究表明，AIR-PE具有较高的粪便清除率和最低的体内代谢。在DSS诱导结肠炎的小鼠模型中，口服给药后，体内成像显示AIR-PE能够有效靶向炎症部位，特异性针对与IBD进展和预后相关的嗜中性粒细胞产生的HClO水平。可排泄的AIRPE还允许通过体外NIRF-II成像对IBD进行直接光学分析，为早期发现炎症病变和监测治疗反应提供了一种无创且更方便的方法，优于典型的临床/临床前检测。我们的工作不仅提出了适用于深层病理事件激活NIR-II成像的第一个半花青素骨架家族，而且强调了开发超灵敏的NIR-II荧光体外检测的必要性，用于临床前和临床环境中各种疾病的早期诊断和管理。
参考文献
Molecular Engineering of Activatable NIR-II Hemicyanine Reporters for Early Diagnosis and Prognostic Assessment of Inflammatory Bowel Disease，Yi Liu, Shanchao Diao, Bankang Ruan, Ya Zhou, Mengya Yu, Guoqi Dong, Weiping Xu, Lulu Ning, Wen Zhou, Yuyan Jiang, Chen Xie* ,Quli Fan*, and Jiagu Huang*, ACS Nano,https://doi.org/10.1021/acsnano.3c13105
