内容提要
T细胞因子/免疫细胞相互作用在组织稳态和疾病期间发挥的基本功能促使靶向荧光团的分子设计以实时监测其活性。许多免疫功能是由细胞因子与其同源受体之间的结合事件介导的，而这些结合事件很难通过活细胞成像来监测。一个典型的例子是白细胞介素-33 (IL-33)，它是先天免疫和适应性免疫中的关键细胞因子，与ST2细胞表面受体相互作用导致下游信号传导和NF-κB和AP-1通路的激活。我们设计了一个化学平台，专门将OFF-to-ON BODIPY荧光团引入到完整的细胞因子蛋白中，并产生了IL-33的第一个天然荧光类似物。BODIPY标记的IL-33衍生物表现出与野生型白介素相当的st2特异性结合和下游生物活性。无洗涤条件下的实时荧光显微镜检测证实了IL - 33通过ST2受体内化，并通过内体途径在细胞内运输。我们的BODIPY标记平台的模块化和多功能性将有助于合成最低标记的荧光细胞因子，作为实时可视化活免疫细胞信号事件的下一代成像试剂。
实验结果与讨论
活性BODIPY构建块的化学合成与光谱表征
将BODIPY标签引入蛋白质结构的最常规策略涉及将活性荧光团与亲核氨基酸直接偶联。尽管是用BODIPY基团标记蛋白质的有效方法，但这些反应不是位点特异性的，并且产生具有多种生物活性谱的异质混合物。Lee和Holland小组最近报道了光激活荧光团(分别为芳基酮和芳基叠氮化物)，用于光控将BODIPY片段插入蛋白质中。这些反应速度快，产率合理，但它们的标记效率也高度依赖于活性残基的可及性。利用琥珀色抑制技术进行遗传密码重编程提供了一种方法，可以将琥珀色终止密码子重新分配到非天然氨基酸上，并在蛋白质结构的单个特定位置引入外源化学片段。一些荧光氨基酸(例如，CouA, ANAP)已经使用这种方法纳入蛋白质中，但没有一个被应用于标记细胞因子，并且很少有例子考虑使用BODIPY荧光团。我们设计了一系列基于BODIPY的荧光团和氟化物，可以适应蛋白质标记。除了始终打开的BODIPY-FL和先前报道的荧光色氨酸Trp-BODIPY氨基酸外，我们还合成了四甲基(2 - 3)和二甲基(5 - 6)BODIPY类似物，包括适合tRNA氨基酰化的基团(例如化合物2和5中的羧酸)和生物正交化学(例如化合物3和6中的丙炔基)。我们在相同的实验条件下分析了BODIPY构建块(1−6)的光学性质。BODIPY化合物表现出相似的激发/发射波长最大值和消光系数。为了评估它们作为OFF-to-ON荧光团用于制备荧光细胞因子的适用性，我们在水介质和模拟疏水微环境(如质膜)的脂质体悬浮液中测量了它们的亮度。在这些实验中，我们观察到基于BODIPY-FL或四甲基BODIPY支架的化合物1−3在两种环境下表现为永远亮的荧光团，并且显示出相似的发射强度，其中BODIPY FL的亮度略高于四甲基BODIPY染料。化合物4−6在疏水介质中表现出显著的环境敏感性和增强的荧光发射，证明了它们作为荧光基块的实用性。发现二甲基BODIPY衍生物比四甲基类似物具有更高的开启释放率。
作为蛋白质标记前体的BODIPY荧光团的化学活化
在合成了一系列具有可变光学性质的BODIPY构建块之后，我们下一步将其衍生为前体，使其能够特异性地结合到蛋白质中。为了利用无细胞翻译将BODIPY荧光团位点特异性地整合到蛋白质中，我们首先需要制备与荧光团酰化的tRNA。为了优化BODIPY标签与tRNA分子的偶联，我们决定制备适合化学氨基酰化的BODIPY荧光团活性酯。因此，我们合成了一系列与天然氨基酸相似的具有不同间隔的BODIPY衍生物，以尽量减少pdCpA和BODIPY荧光团之间的潜在空间位阻。在这些间隔中，我们选择了aPhe，它已被报道与其他荧光团发生tRNA氨基酰化，天然氨基酸l -赖氨酸(Lys)，以及由Lys和氨基己酸(Ahx)偶联产生的较长的间隔。我们共合成了9个BODIPY氨基酸(7−15)，其中每个荧光团2,4和5使用液相化学偶联到三个不同的间隔(即aPhe, Lys,Lys- ahx)。在标准的OxymaPure和DIC条件下，Lys和Lys- ahx与所有荧光团反应;然而，亲核性差的aPhe需要偶联剂PyOxim在三乙胺的存在下生成相应的BODIPY加合物(化合物9、12和15)。所有9种化合物都被纯化为甲酯或乙酯，收率不同，并在pdCpA酯化之前立即用稀释的NaOH溶液水解成相应的羧酸。重要的是，该库具有多种BODIPY氨基酸作为tRNA衍生化的潜在构建块，包括不同大小的荧光团和常开荧光团(例如，分子量从625到910 Da)和可变的log P值(例如，aPhe > Lys- ahx > Lys的递减顺序，从0.24化合物12到- 1.75化合物13)。
氨基酸修饰BODIPY与tRNA的结合
在完成Boc保护的BODIPY氨基酸的合成后，我们优化了一个程序，从BODIPY氨基酸的氨基末端去除Boc保护基团，考虑到它对酸性介质的不稳定性，这将保留一些荧光团的完整性。这一步很重要，因为连接到tRNA分子的BODIPY氨基酸必须包含一个自由的氨基，以便它们特异性地结合到蛋白质中。在测试了几种脱保护条件后，我们发现boc保护的BODIPY氨基酸用5:95(三氟乙酸(TFA):乙腈(ACN))溶液在0°C下处理10分钟的降解程度最低，并继续合成包含BODIPY氨基酸的荧光pdCpA偶联物文库，以确定每个荧光团最合适的间隔物。我们采用了标准的化学氨基酰化方法，即用1,1 ' -羰基二咪唑(CDI)水解和活化BODIPY氨基酸(7−15)，然后在DMF:H2O的混合物中与pdCpA二核苷酸反应。随后，用TFA:ACN(5:95)处理所有BODIPY-pdCpA偶联物，并与T4 RNA连接酶1在4°C下孵育1小时，将其与McTrp162(即解码UAG的抑制tRNA)酶联。为了比较不同BODIPY氨基酸的生物偶联程度，在500 nm激发后扫描tbe -尿素凝胶的荧光发射。此外，我们通过比较水介质和二氧六环中的荧光带强度，评估带电tRNA分子是否保留了天然BODIPY氨基酸的常亮或荧光特性。考虑到后者有利于对环境敏感的BODIPY偶联物的开启效应，而不是对永远开启的荧光团的开启效应我们的分析结果强调，四甲基和二甲基BODIPY染料分别在使用aPhe和Lys间隔剂时与tRNA结合最好，而使用Lys- ahx间隔剂时，Trp-BODIPY能有效地结合到tRNA中，这突出了后者荧光团的体积增加。此外，凝胶分析证实，带BODIPY电荷的tRNA保留了其前体氨基酸的光学性质;也就是说，含有环境敏感的BODIPY荧光团11和13的tRNA在二氧六环中显示出3倍和8倍的荧光增强。另一方面，在比较两种不同微环境时，用BODIPY荧光团9标记的tRNA在荧光发射上的差异很小。在制备了几个带BODIPY电荷的tRNA分子后，我们接下来通过尝试将其掺入模型蛋白二氢叶酸还原酶(DHFR)的n端(例如，位2，空间位阻处于边缘)来评估其核糖体整合能力68为此，我们使用定点诱变技术在DHFR的2号位置引入一个UAG密码子，并加入释放因子1抑制剂Api13769，以确保UAG完全重新分配。在这些条件下，三种BODIPY氨基酸(9、11和13)都没有被大量并入模型蛋白中，作为核糖体介导的肽键形成的底物，相容性有限。作为阳性对照，我们使用了先前报道的由aPhe和BODIPY- fl63偶联产生的氨基酸aPhe-BODIPY FL。在相同的实验条件下，可以有效地结合到DHFR中。综上所述，这些结果表明(1)BODIPY荧光团可以通过化学氨基酰化有效地连接到tRNA上，(2)为了将不同的BODIPY荧光团有效地连接到tRNA构建体上，需要筛选和选择氨基酸间隔剂。(3)大于BODIPY-FL的荧光团可能不容易被核糖体机制接受，并且与tRNA氨基酰化后的体外无细胞翻译不相容。
利用生物正交连接将BODIPY衍生物与蛋白质的位点特异性结合
为了将BODIPY荧光基团引入到蛋白质结构中，我们接下来评估了炔修饰的BODIPY荧光基团与适当功能化的蛋白质之间的生物正交偶联。我们首先优化了炔修饰的BODIPY化合物3与叠氮吡啶之间的生物正交偶联。我们测试了两种水溶性还原剂(即抗坏血酸钠和三(2-羧基乙基)膦(TCEP))，两种螯合剂(即三(羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)和2-[4-{(二[(1-叔丁基三唑基)甲基]氨基)甲基三唑基]乙酸(BTTAA))以及不同比例的化合物3与叠氮酸。在这些反应条件中，我们发现抗坏血酸钠和THPTA分别是最合适的还原剂和螯合剂，同时化合物3比叠氮多10倍。最后，我们利用这些反应条件将BODIPY荧光团3和6偶联到模型蛋白DHFR上。首先，我们使用化学氨基酰化，通过pdCpA连接将叠氮化偶氮体与McTrp1 tRNA连接，然后在体外成功表达蛋白，并通过cuaac介导将荧光团3和6与DHFR偶联。优化了BODIPY荧光团3和6进入模型蛋白的位点特异性结合后，我们下一步决定采用该方案制备新的IL-33生物活性类似物。使用融合FPs荧光标记小细胞因子(如IL-33)的一个主要限制是，与天然细胞因子相比，所产生的构建物可能表现出受损的活性GFP与IL-33的c端融合会损害细胞因子的生物活性。为了使IL-33与BODIPY荧光团3和6的衍生化合理化，并确定蛋白质序列内的最佳标记位点，我们检查了IL-33/ST2二元复合物的结构，并在IL-33与其受体ST2的结合界面上选择了两个疏水残基(Tyr143和Tyr163)。这些残基不参与IL-33和ST2之间的基本相互作用，但它们突出穿过结合界面，导致微环境变化，可能在受体结合时激活BODIPY氟化物。我们通过制备两个突变体来分析在IL-33的143和163位置引入大团的效果，我们用报道的光笼化的Tyr取代了天然的Tyr残基(pcY)，该突变体可以很容易地通过特异性aaRS/抑制tRNA Methanocaldococcus jannaschi对(MjpcYRS/ MjtRNACUA)引入大肠杆菌的蛋白质中。在这些实验中，MjpcYRS/MjtRNACUA对被克隆到pULTRA质粒中，并转化到含有编码IL-33蛋白的pSANG10质粒的BL21(DE3)pLysS细胞中。IL-33编码序列包括帧内143或163位的琥珀色停止密码子，用于pcY结合和His6标记用于纯化。从周质中提取两种蛋白(IL-33 Y143pcY和IL-33 Y163pcY)，进行纯化，并用凝胶电泳进行表征，以确认pcY的位点特异性结合。采用ELISA法比较IL-33 Y143pcY和IL-33 Y163pcY对ST2和HpARI的结合亲和力。与野生型IL-33相比，这两个突变体对ST2的亲和力相当;然而，IL-33 Y163pcY与抑制蛋白HpARI的结合明显降低，表明靠近Tyr163残基的大块片段可能受到干扰。鉴于IL-33 Y143pcY与野生型IL-33具有相似的分子识别特性，我们选择143位置作为BODIPY荧光团无扰动掺入的首选位点。接下来，我们利用框架内琥珀色终止密码子位于143位的pSANG10-IL33质粒，将BODIPY荧光团3和6特异性地引入IL-33(即首先通过叠氮结合，然后通过cuaac介导的偶联，然后纯化)。作为阳性对照，我们还合成了荧光IL-33类似物，通过无细胞翻译直接引入ape - BODIPY FL氨基酸。所有三种IL-33类似物(例如，ape - BODIPY FL的IL-33(1)， IL-33(3)和IL-33(6))通过凝胶内荧光和Western blot分析进行了表征。当反应体积在250 μL左右时，BODIPYy标记的IL-33的最终蛋白产量在12 ~ 18 μ mL−1之间，而未标记的IL-33的最终蛋白产量接近50 μ mL−1。我们还比较了所有IL-33突变体与其受体ST2结合前后的荧光反应。在这些实验中，我们测量了IL-33类似物(50 μg mL−1)与ST2 (200 μg mL−1)孵育前后的荧光发射，观察到IL-33(6)在受体结合后具有显著的开启效应(增加约4倍)，而IL-33(1)和IL-33(3)的发射强度没有显著变化。这些结果证实了荧光团1和3的永远开启行为以及荧光团6的荧光行为(即，并强调IL-33(1)、IL-33(3)和IL-33(6)是首次报道的具有天然识别特性的IL-33的荧光和荧光类似物。最后，我们在大肠杆菌中扩大了IL-33(3)和IL-33(6)的生产，我们首先用含有MjRS(CNF) /MjtRNA对和pSANG10-IL33-143TAG质粒的pULTRA-CNF质粒转化BL21(pLysS)细胞。从外周血质中提取IL-33 Y143azidoPhe蛋白，在1升培养中得到1.6 mg蛋白表达。将IL-33(3)和IL-33(6)分别偶联到BODIPY荧光团3和6上，通过考马斯氏染色和凝胶内荧光分析进行表征。
荧光性IL-33突变体用作活细胞的免水洗显像剂
我们已经合成了IL-33(1)、IL-33(3)和IL-33(6)作为IL-33的衍生物，并利用IL-33 HEK-Blue报告细胞系检测了它们的生物活性，其中IL-33结合和通过激活NF-κB和AP-1途径的下游信号传导可以很容易地通过胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的分泌来监测。简要地比较了在1.5 ~ 100 ng mL−1范围内，不同浓度下未标记的IL-33与三种荧光衍生物IL-33(1)、IL-33(3)和IL-33(6)的生物活性。采用脂多糖(LPS)作为阴性对照，因为它可能存在于无细胞翻译系统产生的蛋白质中，并且验证与IL-33不同，toll样受体4 (TLR-4)的刺激不会通过myd88依赖性反应增加SEAP活性。如图5所示，所有衍生物都保留了与未标记IL-33相似的下游信号传导能力。接下来，我们用ST2- fc作为IL-33抑制剂和hbpbari_hom2作为ST2抑制剂孵育细胞，证实了观察到的信号是由于IL-33和ST2受体之间的特异性识别。在所有这些条件下，我们观察到SEAP活性几乎完全降低，证实了来自IL-33(1)、IL-33(3)和IL-33(6)的信号是响应活性的白细胞介素而产生的。在确认了IL-33(1)、IL-33(3)和IL-33(6)作为IL-33的荧光类似物的适用性后，我们决定评估它们作为st2介导的内化显像剂的应用。Zhao小组最近报道IL-33可以诱导ST2受体的内化;然而，关于活细胞中IL-33/ST2复合物的细胞内运输和动力学的信息非常有限。为了进行这些实验，我们将表达ST2受体的HEK-Blue报告细胞与IL-33(1)、IL-33(3)和IL-33(6)分别孵育5分钟，然后用荧光共聚焦显微镜对它们进行成像。考虑到不同蛋白质的不同光学行为(例如，IL-33(1)和IL-33(3)包含始终打开的荧光团，而IL-33(6)包含打开的荧光团)，我们还比较了它们洗涤前后的荧光信号。从st2介导的信号传导的功能分析结果来看，我们观察到所有三种IL-33类似物都被内化到细胞中。此外，我们观察到IL-33(1)和IL-33(3)在PBS洗涤一次后荧光信号减少，这可能表明细胞非特异性内化。相反，IL33(6)可能是st2介导内化的更准确的报告者，因为它在细胞洗涤前后的荧光强度相似，细胞内染色呈剂量依赖性，而在未转染的HEK293细胞中缺乏荧光信号。高倍荧光显微镜图像显示亚细胞定位于溶酶体腔室，与溶酶tracker Red部分共定位，提示通过内体途径内化。考虑到IL-33的荧光特性(6)，我们利用该蛋白通过无水洗荧光共聚焦显微镜对st2介导的内化率进行了时间过程分析。用核反染剂DRAQ5对报告细胞进行反染，并通过延时成像进行监测。我们的结果表明，几分钟后可以观察到ST2介导的内化，我们也证实了细胞内IL-33(6)的荧光信号完全是由于与ST2受体的相互作用，与ST2拮抗剂hbpbari_hom2的阻断实验证实了这一点。最后，我们在活的HMC1.1人肥大细胞中进行实验，作为可以被IL33.78刺激的代表性免疫细胞系。具体来说，我们使用荧光显微镜滴定IL-33(6)，观察细胞的st2特异性和剂量依赖性荧光染色。我们证明了IL-33对HMC1.1细胞的标记(6)也可以通过流式细胞术进行监测，证明了我们的荧光类似物与不同荧光模式的兼容性。总之，这些结果表明，IL-33(1)、IL-33(3)和IL-33(6)保留了未标记的IL-33对其天然受体的结合亲和力，IL-33(6)可以作为荧光报告蛋白实时成像IL-33/ ST2信号事件。
总结
我们已经优化了一个新的化学平台，将BODIPY荧光团引入小细胞因子，并生成了第一个具有天然生物活性谱的白细胞介素IL33的荧光类似物。我们合成了15个具有可变物理化学和光学性质的BODIPY荧光团，包括化学上不同的连接体和功能化氨基酸基团。我们证明了BODIPY荧光团可以通过化学氨基酰化有效地与tRNA结合，并优化了连接器，以有效地将不同的BODIPY荧光团连接到tRNA结构上我们合成了三种标记的IL-33类似物，它们都在143位置上带有BODIPY标签，并且荧光发射(即探针IL-33(1)和IL-33(3))或打开行为(即探针IL-33(6))。与IL-33- gfp构建体不同，这三种IL-33衍生物表现出与野生型IL-33相当的st2特异性结合和下游活性，从而证实了我们的化学方法用于微创标记细胞因子的适用性。最后，我们使用荧光探针IL-33(6)对表达ST2受体的活细胞进行免洗实时荧光显微镜观察，证实了选择性受体介导的IL-33内化及其通过内体途径在细胞内运输。
参考文献
Inserting “OFF-to-ON” BODIPY Tags into Cytokines: A Fluorogenic Interleukin IL-33 for Real-Time Imaging of Immune Cells, Abigail E. Reese, Fabio de Moliner, Lorena Mendive-Tapia, Sam Benson, Erkin Kuru, Thomas Bridge, Josh Richards, Jonathan Rittichier, Takanori Kitamura, Amit Sachdeva, Henry J. McSorley, and Marc Vendrell*, ACS Cent. Sci. 2024, 10, 1, 143–154， https://doi.org/10.1021/acscentsci.3c01125
