内容提要
近红外二区(NIR-II)光学分子成像开启了高质量体内成像的新革命，但一直受到组织自身荧光背景和NIR-II探针开发的阻碍。我们通过H2S响应的NIR-II花菁染料(受体，LET-1055)和H2S惰性半花菁染料(给体，Rh930)，制备了基于FRET共振能量转移的硫化氢NIR-II比度荧光传感器。该传感器不仅具有高灵敏度和选择性，而且对H2S具有快速反应动力学和相对较低的检测限，可实现原位肝脏和结肠肿瘤的体内比度NIR-II荧光成像和药物诱导的肝脏H2S波动的可视化，为推进NIR-II活性传感在体内临床诊断的可行性提供了支持。
实验结果与结论
第二种近红外窗口H2S探针的合成与表征
为了在NIR-II窗口中有效响应H2S，合成了一种在NIR-II区域具有FL发射的菁染料(LET-1055)。LET-1055在二氯甲烷中的最大吸光度/发射度为1,010/1,055 nm，量子产率为0.88%。在与H2S反应后，LET-1055中HS -与苯并吡咯基团之间的亲核加成反应可以显著地抑制其NIR-II的释放，并可以通过加入Cu2+来恢复。我们接下来评估了LET1055对H2S的传感能力。在LET-1055溶液中加入不同浓度的Na2S, NIR-II的吸收和发射波段有明显的下降趋势。对LET-1055与S2−反应的时间依赖性动力学研究表明，在1010 nm处吸光度(Ab1010)和FL强度(FL1055)快速下降。在15min内达到最低水平。该反应过程也可以通过NIR-II荧光成像系统实时显示。这些结果表明，LET-1055对S2−具有快速反应动力学，随后进行了LET-1055的选择性实验。因此，LET-1055对其他干扰(K+， Na+， Ca2+， Mn2+， Co2+， Fe2+， Cl−，HSO3−，SO42−，S2O32−，L-Arg, Vc和GSH)都是惰性的，但只对S2−有特异性响应。这些结果表明LET-1055是一个特异性的H2S响应NIR-II荧光团。
基于FRET的比率NIR-II窗口H2S传感器的构建
为了提高LET-1055对H2S的灵敏度，我们战略性地设计了一个FRET平台，其中具有H2S淬灭特性的LET-1055作为能量受体，而最大吸光度/发射波长为890/930 nm的Rh930作为能量供体，因为这两个发射器之间的吸光度/发射波段有足够的重叠。因此，Rh930不仅可以作为LET-1055可靠的能量供体，还可以抵抗目标信号干扰，保证H2S检测的准确性。随后，我们通过两亲性的DPE- PEG2000)辅助包封Rh930和LET-1055 (Rh930:LET-1055)构建FRHS。制备的FRHS具有Rh930和LET-1055的特征吸收/发射波段。透射电镜(TEM)图像显示，FRHS以球形形貌为主，平均尺寸约为100 nm。通过动态光散射(DLS)评估FRHS的尺寸分布。结果表明，FRHS的水动力直径约为170 nm，比TEM测量的直径大。这种尺寸差异可能是由于DSPE-PEG2000涂层和TEM样品制备干燥过程中FRHS的收缩。随后，我们评估了FRHS对H2S的敏感性和特异性。随着S2−的加入，FRHS的NIR-II FL强度在930 nm处(FL930)增强，在1060 nm处(FL1060)减弱，FL930/FL1060强度与S2−浓度在0 ~ 20 μM范围内呈良好的线性相关关系。计算出S2−的LOD为96 nM，低于健康组织，因此我们可以监测病理组织中的H2S水平。此外，FRHS与S2−的反应动力学随时间的变化表明，FRHS对S2−也具有快速的反应动力学，类似于单一的LET-1055。我们应用NIR-II FL成像来显示上述FRET过程。在S2−溶液孵育过程中，通道2 (Ch.2, 1000 ~ 1700 nm，滤波器:长通[LP] 1100 nm)的NIR-II荧光强度对FRHS表现出持续下降的行为，而通道1 (Ch.1, 900 ~ 1000 nm，滤波器:短通[SP] 1000 nm和LP 900 nm)的信号表现出相反的趋势。因此，比值法NIR-II FL成像由2通道之比(记为Ch.1/Ch.2)描绘，显示出明显的FL信号增强。结合FRHS对S2−的良好选择性， FRHS对S2−诱导的比例NIR-II FL成像具有很大的H2S检测能力。
活细胞中H2S的比例NIR-II FL成像
得益于FRHS对H2S的高灵敏度和选择性，我们接下来评估了FRHS在体外比例NIR-II FL成像中H2S的可靠性。我们选择肝脏(HepG2和Hepa 1-6)和结肠癌(CT-26)细胞株进行H2S水平的研究，因为它们过表达CBS和CSE来生物合成内源性H2S，同时选择正常细胞株HEK293T作为对照组。甲基噻唑四氮唑(MTT)实验表明，即使在80 μM的高浓度(LET-1055定量)下，FRHS对这些细胞系也具有优越的生物相容性。我们采集了2通道的NIR-II滤光信号来映射比率滤光信号。FRHS作用6小时后，HepG2、Hepa 1-6和CT-26细胞的FL信号分别较正常细胞(HEK293T)增强1.6倍、1.2倍和1.5倍，同时主成分分析(PCA)显示FRHS明显分离了正常细胞和癌细胞，细胞内H2S水平较高。为了进一步证明FRHS在体外检测H2S的可靠性，我们随后研究了癌细胞中H2S的波动。用ZnCl2 (H2S的清除剂)预处理后，癌细胞的比例FL信号显著降低。相比之下，外源Na2S预处理Hepa 1-6细胞和FRHS处理后，其比值为ch1 / ch2与对照组相比，FL信号增强约4.2倍。此外，利用生物合成H2S的前体L-Cys上调细胞内H2S水平，随后培养FRHS。结果，观察到明显的Ch.1/ Ch.2 FL信号，为对照组的2.5倍。哪个可以被有效地抑制DL-propargylglycine (PAG)抑制内源性CSE的活性。同时，HepG2和CT-26细胞中H2S的波动趋势相似。这些结果强烈表明FRHS能够高度特异性和敏感性地检测癌细胞中的内源性H2S。
原位肝肿瘤中H2S的比例NIR-II FL成像
受FRHS在体外检测H2S的良好表现的鼓舞，我们评估了FRHS在原位肝肿瘤中比例NIR-II FL成像H2S的可行性。将转染了荧光素酶的HepG2细胞(HepG2/Luc)接种到小鼠肝脏润滑油中，建立原位肝脏肿瘤。14d后，通过IVIS光谱成像系统采集肝脏内强生物发光(BL)信号，表明原位肝肿瘤构建成功。随后，将FRHS静脉注射小鼠，808 nm激光照射(0.3 W cm−2)在不同的时间点(1、2、4、8和12 h)。在Ch.1和Ch.2分别采集NIR-II FL信号，很明显，健康小鼠组Ch.1和Ch.2的信号呈相似的增加趋势，导致小鼠体内和离体主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的比例信号变化不明显。然而，对于荷瘤小鼠组，在注射后8 h, ch1中NIR-II信号明显增强(p.i.)， ch2中NIR-II信号的增加非常微弱，接收到明显的比例信号变化，这表明FRHS可以有效检测肝脏肿瘤细胞产生的内源性H2S。值得注意的是，与健康小鼠相比，体内和离体肝脏的比例NIR-II FL信号分别增强了5.8倍和6.3倍。结合离体肝组织光学图像，上述结果表明FRHS具有体内比例NIR-II FL成像H2S的可行性。
为了进一步证实FRHS对H2S的比例NIR-II FL成像的可靠性，我们使用荧光素酶转染的Hepa 1-6细胞(Hepa 1-6/Luc)构建小鼠原位肝肿瘤，接种14天后肝脏内强烈的BL信号证实了这一点。然后在不同时间点(1,2,4,8,12 h) 808 nm激光照射(0.3 W cm−2)，健康小鼠Ch.1和Ch.2中NIR-II FL信号呈时间依赖性增加趋势，这可能与肝脏中FRHS的代谢有关。相反，比值的ch1 / ch2荷瘤小鼠的NIR-II FL信号分别比健康小鼠高4.8倍(体内肝脏)和6.5倍(离体肝脏)。这一观察结果与原位HepG2荷瘤小鼠的结果一致。结合离体肝组织光学图像(蓝色虚圈为原位肝肿瘤结节)，上述结果表明FRHS能够通过比例NIR-II FL成像有效检测肝脏肿瘤中的H2S。
原位结肠肿瘤中H2S的比例NIR-II FL成像
除肝癌外，结直肠癌也过表达CBS和CSE，用于内源性H2S的生物合成，可调节血管生成和细胞增殖。因此，在结直肠癌中可视化H2S对揭示相关病理信息具有重要意义。用荧光素酶转染的CT-26细胞(CT-26/Luc)建立原位CT-26结肠肿瘤，在NIR-II FL成像系统上记录结肠肿瘤中H2S的比例NIR-II FL成像。按照同样的思路，选择健康的老鼠作为对照组，然后静脉注射FRHS。显然，对于健康小鼠，在808 nm激光照射(0.3 W cm−2)下，在结肠中找不到NIR-II FL信号，仅在肝脏中观察到，这主要归因于FRHS的正常代谢。幸运的是，对于CT-26肿瘤小鼠，NIR-II信号在FRHS的12 h p.i.显示出Ch.1的明显增强，并且显示出Ch.2的微弱增加，获得明显的比例Ch.1/Ch.2结肠内FL信号变化。值得注意的是，比值型NIR-II FL信号分别比健康小鼠高6.0倍(体内组)和5.2倍(离体组)。小肠苏木精-伊红(H&E)染色图像显示明显的CT-26肿瘤区域。
药物性肝损伤中H2S的比例NIR-II FL成像
肝病的诊断与认识。在这些疾病中，药物性肝损伤备受关注。尤其在LPS诱导的肝脏炎症中，CSE表达上调。为此，我们建立了LPS诱导的肝脏炎症模型。首先，将小鼠随机分为4组(Control, L-Cys, LPS + L-Cys, LPS + L-Cys + PAG)。对照组小鼠腹腔注射生理盐水(100 μl)，每小时6.5 h静脉注射FRHS (5 mg kg−1)，然后用NIR-II FL成像系统对小鼠进行成像。随着时间的推移，Ch.1和Ch.2的FL信号逐渐增加，表明FRHS在小鼠肝脏中有效积累。为了进一步验证H2S在肝脏中激活比例荧光信号，小鼠腹腔注射L-Cys (100 μl, 1 mM)来上调肝脏H2S的产生，然后静脉注射FRHS (5 mg kg−1)。NIR-II FL信号在ch1中表现出明显的时间依赖性增强，但在ch2中表现出微弱的变化。因此，比值性明显的ch1 / ch2在小鼠肝脏中观察到NIR-II FL信号，在每小时3小时时，与健康小鼠相比，信号增强了4.9倍。另外，先给小鼠注射LPS，再以6.5 h腹腔注射L-Cys。FRHS的最强比值为Ch.1/Ch.2在体内和离体观察NIR-II FL信号。信号为6.3倍(体内肝脏)， 6.0倍(离体肝脏)，分别高于健康小鼠。此外，当小鼠腹腔注射PAG通过抑制CSE活性来抑制H2S的产生时，比值为Ch.1/Ch.2在体内和离体肝脏中，NIR-II FL信号均显著降低。为了确认肝脏损伤程度，我们评估了2个重要肝脏指标，即天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的活性。lps处理小鼠的AST和ALT水平明显升高，经PAG预处理后可有效抑制。这些证据表明FRHS可用于肝损伤小鼠肝脏H2S水平的灵敏检测。
为了进一步证明FRHS用于肝脏H2S敏感检测的可行性，我们应用CBS激活剂SAM提高肝脏内源性H2S水平。在SAM的每小时12小时静脉注射FRHS (5 mg kg - 1)。荧光图像显示，注射SAM的小鼠肝脏中NIR-II荧光信号比生理盐水组高得多，表明SAM注射可以增强H2S水平。值得注意的是，离体脏器的荧光图像显示FRHS在肝脏的积聚，比值为Ch.1/Ch.2与未注射SAM的小鼠相比，注射SAM的小鼠肝脏中的NIR-II FL信号增强了8.8倍)，表明SAM注射诱导了肝脏内源性H2S的增强。基于上述分析，FRHS能够对活小鼠体内的H2S进行灵敏的比例NIR-II荧光成像。
结论
目前，基于花菁或半花青素荧光团的荧光探针在PA或FL成像技术的疾病诊断中备受关注，因为这些荧光团易于定制和精确的分子结构以及荧光探针相对较高的成像灵敏度。为了进一步提高成像质量和SBR，各种成像策略，包括后辉成像和引入CRET, BRET或FRETeffect，被整合到荧光探针平台中。此外，定位于NIR-II窗口的光具有优越的深层组织穿透能力，经颅神经调节有力地证明了这一点，在体内各种疾病相关生物标志物的可视化中显示出巨大的潜力。因此，NIR-II PA或FL成像技术与ABS平台的结合是一种很有前景的H2S相关疾病体内敏感诊断途径。本研究通过LET-1055和Rh930的结合，构建了基于fret的比率型NIR-II窗口H2S传感器(FRHS)，用于各种疾病中H2S的灵敏、精确的原位成像。值得注意的是，LET-1055表现出强烈的NIR-II发射，它可以被H2S选择性猝灭，但对其他活性物质是惰性的。此外，LET1055能够通过引入对各种反应物质具有良好惯性的Rh930来控制比率NIR-II FL成像。值得注意的是，FRHS可以被H2S敏感和选择性地激活，产生比例NIR-II FL图像，并且在生理条件下对H2S表现出快速的反应动力学。同时，FRHS具有较低的LOD，可对原位肝脏和结肠肿瘤进行比例NIR-II FL成像，并可可视化lps诱导的肝损伤和sam诱导的肝脏H2S波动中的H2S水平，从而加深我们对体内H2S相关疾病的认识。因此，我们的工作强调了FRHS在体内H2S检测/成像方面的潜力。
参考文献
A FRET-Based Ratiometric H2S Sensor for Sensitive Optical Molecular Imaging in Second Near-Infrared Window，Shan Lei , Kejia Jiang , Chenqing Zhang , Wei Sun, Yuantao Pan , Dong Wang , Peng Huang , and Jing Lin*，Research 2023, 6, 0286. https://doi.org/10.34133/research.0286
