内容提要
本文设计并合成了一类新型染料GX作为可活化的NIR-II PA平台，其中GX-5的吸收/发射波长延伸至1082/1360 nm。重要的是，GX染料在NIRII PA 3D成像中对小鼠血管结构具有强的组织穿透深度和高分辨率，并且在NIRII荧光（FL）成像中具有高信噪比。此外，为了证明GX染料的适用性，第一个NIR-II PA探针GX-5-CO活化一氧化碳（CO）的工程和高对比度NIR-II PA和FL成像揭示高血压小鼠的CO水平的增强。我们期望GX染料的许多衍生物将被开发以提供多功能的NIR-II PA平台，用于设计各种各样的可活化的NIR-II PA探针作为生物医学工具。
结果与讨论
为了获得基于罗丹明的NIR-II PA染料，合成GX 1 -5 PA染料。我们研究了GX染料在不同溶剂中的化学物理性质。其中，GX 1 -5在1，2-二氯乙烷（DCE）中的荧光量子产率分别为0.143%、0.177%、0.901%、1.150%和1.003%（表S7-S9）。GX 1 -5在H2O中的最大吸收/发射波长分别为691/924 nm、736/928 nm、889/1035 nm、896/1048 nm和905/1066 nm。值得注意的是，GX-5在H2O中的吸收/发射波长可以扩展到1082/1360 nm。这可能是溶剂效应的结果。染料GX在H2O体系中的显着性能表明，这类新的NIR-Ⅱ PA染料在生物体系中具有广阔的应用前景。与之前构建的NIR-I罗丹明衍生物CS相比，GX-5的最大吸收波长红移超过200 nm。上述结果表明，GX具有近红外-Ⅱ类染料的吸收和发射。值得注意的是，为了验证GX染料的上级光稳定性，使用临床批准的ICG作为参考，用CW激光照射GX 1 -5的溶液。60分钟后，ICG的吸收强度降低约60%，但GX 1 -5的吸收强度仅降低1- 14%，表明GX染料比ICG更光稳定。此外，我们进一步比较了染料GX 1 -5与ICG在血液中的稳定性，发现染料GX 1 -5的光稳定性仍远优于ICG。为了说明GX染料的潜在生物适用性，我们针对一系列常见的活性氧物质（例如：ONOO-，H2O2，HClO）和生物相关的亲核试剂（例如H2 S，GSH和Cys）对其进行了测试，以评估化学稳定性。此外，测试了染料GX 1 -5在生理盐水和FBS中的溶解度，发现GX 1 -5具有良好的溶解性。为了探索染料GX用于PA成像的潜力，我们首先在HEPES溶液（10 mM，pH 7.4，含有10%DMSO和1%tween-80）中进行PA感测测试。GX 1 -5显示出优异的PA信号，表现出良好的NIR-II FL信号。同时，我们研究了染料GX的PA和FL信号在激光照射3小时内的变化。染料ICG在90分钟后几乎没有信号，而GX 1 -5在3小时时仍显示出良好的PA和FL信号。这些结果表明，染料GX可能是有利的NIR-II PA和FL成像剂在体内应用。
用于生物医学成像的优良NIR-II染料的先决条件是低细胞毒性。染料GX表现出极低的细胞毒性。接下来，我们研究了NIR-II GX染料在体内比NIR-I罗丹明衍生物CS的优势。将GX 1 -5和CS分别注射到活体小鼠体内。其中，在3D PA成像中，CX-5的组织穿透深度可达10 mm，而CS的组织穿透深度仅为5 mm。同时，通过NIR-II 3D PA成像和2D FL成像系统，我们发现GX-5仍然表现出长达6小时的长期生物成像能力，而CS在6小时内几乎没有检测到信号。上述结果表明，染料GX可以应用于多种成像模式，以检测生物体的深部组织，并获得多重信息。相比之下，许多染料（包括近红外染料）在渗透深度和实时成像方面受到限制，导致获取高质量图片和视频的障碍。在本研究中，我们使用GX-5或CS对小鼠全身进行了NIR-II PA和FL成像。GX-5能清晰地分辨小鼠血管。即使在640×512像素的分辨率下，GX-5也可以提供高SNR的NIR-II 2D FL图像。 A中的血管在1 - 2 - 3处的半高全宽通过高斯拟合进行拟合，即使直径为0.21 mm的血管也可以区分（ C）。更重要的是，GX-5通过高分辨率NIR-II PA成像更全面地显示了小鼠血管的分布。GX 5的3D NIR-II PA成像视频从多个角度获得了小鼠全身血管的分布。此外，血管系统（四个纵向血管）可以通过3D NIR-II PA成像观察到（D）。值得注意的是，3D NIR-II PA的血管分辨率优于2D FL成像。这进一步表明GX-5可能具有出色的NIR-II 3D PA成像和2D FL成像能力。与此形成鲜明对比的是，CS（近红外-I罗丹明衍生物）不能以高分辨率对血管系统成像。
羧酸改性染料GX的优异的近红外-Ⅱ PA和FL生物成像性能和有趣的生物物理性能启发我们研究通过其螺环化开发染料GX作为PA或FL探针的可能性。内源性CO参与一系列生理过程，包括抗炎反应、神经传递、血管平滑肌和血管舒张。CO的异常水平可导致严重的疾病，例如呼吸系统疾病、阿尔茨海默病和高血压。然而，可活化的NIR-II探针尚未用于检测CO。在此，我们工程化了第一个NIR-II PA CO活化探针GX-5-CO。
GX-5-CO的合成路线，化合物通过1H NMR、13 C NMR和HRMS表征。探针GX-5-CO与CO可能的反应机理见图。加入CORM-3后，GX-5-CO溶液的最大吸收和发射逐渐增加，并在100 μM时达到饱和点。加入100 μM CORM-3后，最佳吸收值增加了200倍，吸收值与CORM-3浓度呈良好的线性关系，检测限为1.2×10 6 M，表明GX-5-CO对CO响应具有良好的灵敏度。在将CORM-3加入GX-5-CO后进行的时间依赖性研究表明反应是快速的，并在2分钟内达到最大值。在GX-5-CO对生物活性物质的响应中，CORM-3存在时GX-5-CO的吸收值明显增加，而其他物质仅引发微小变化。此外，GX-5-CO在HEPES溶液（10 mM，pH 7.4，10% DMSO和1% tween-80）中对CO仍有良好的响应。因此，这些结果支持GX-5-CO具有进一步体内成像应用的潜力。
为了探索GX-5-CO在生物系统中的适用性，通过MTT法将GX-5-CO与HeLa细胞孵育，观察到低细胞毒性。此外，为了评估探针对体内CO的特异性反应，小鼠皮下注射GX-5-CO和不同浓度的CORM-3。仅用GX-5-CO处理的小鼠表现出微弱的NIR-II PA和FL信号。随着增加剂量的CORM-3的加入，可以观察到PA信号的显著增强。同时，FL成像也获得了类似的结果。上述结果表明，GX-5-CO可用于近红外-Ⅱ PA/FL成像，实时无创检测体内CO水平的上调。为了研究GX-5-CO在高血压小鼠中特异性成像的能力，我们建立了具有血管紧张素II（Ang II）的高血压小鼠模型。氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪是治疗高血压的常用药物。据文献报道，三者联合使用可取得较好的治疗效果。因此，我们进一步用氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪治疗高血压小鼠。采用无创血压测量系统对正常小鼠、高血压小鼠和治疗组小鼠的血压进行了研究。对照组小鼠的舒张压（DBP）和收缩压（SBP）分别为73和96 mmHg，而高血压组小鼠的DBP和SBP分别增加至112和145 mmHg。这表明高血压小鼠模型的成功构建。而且观察到治疗组小鼠的血压与对照组小鼠的血压基本相同，表明用于高血压治疗的小鼠模型构建成功。采用PA/ FL成像技术观察高血压小鼠和正常小鼠不同时间点GX-5-CO信号的变化。对于对照组和治疗组小鼠，在GX-5-CO注射后未获得明显的PA/FL信号。对于高血压小鼠，无论是近红外II型3D PA还是实时FL成像，信号都随着时间的推移逐渐增加，4 h后达到最大值。这些数据为GX-5-CO在高血压小鼠中的视觉检测和治疗提供了进一步的证据。此外，对空白组、高血压组和高血压治疗组小鼠进行成像后，取出上述各组小鼠的心、肝、脾、肺和肾，以探索器官的分布。我们发现只有高血压组的小鼠显示荧光被打开，并且主要集中在肝脏组织中，在其他器官中分布较少。这可能是由于肝脏是体内主要的代谢器官。
总结
我们提出了一种新的策略来设计和合成一类可活化的NIR-II PA染料GX，其具有通过螺环化的羧酸控制的光学ON-OFF开关机制，其中GX-5的吸收/发射波长延伸至1082/1360 nm。密度泛函理论计算表明，GX具有罗丹明染料的典型结构特征。与可见光区的罗丹明B和近红外I罗丹明CS相比，GX-5具有更小的分子轨道间隙和更大的偶极矩。重要的是，为了进一步证明染料GX的优异光学和PA性质，我们采用GX-5分别通过PA和FL成像在3D和2D中可视化小鼠血管的分布和结构。此外，以GX-5为激活平台，我们进一步构建了第一个用于特异性检测CO的NIR-II探针GX-5-CO，其能够通过高对比度NIR-II PA和FL成像揭示高血压小鼠中CO水平的增强，证明了我们的新GX NIR-II功能性罗丹明染料的价值。
参考文献
A Class of Activatable NIR-II Photoacoustic Dyes for High-Contrast Bioimaging，Jiangfeng Li, Jiangyan Wang, Lizhen Xu, Hanwen Chi, Xing Liang, Juyoung Yoon,* and Weiying Lin*，Angew. Chem. Int. Ed. 2023, e202312632 ，doi.org/10.1002/anie.202312632
